neues experiment mit max:

wir haben auf einem mica eine lysozym-schicht. lysozym ist ein protein. in diese schicht kratzen wir mit einem cantilever linien, kästchen, etc. dafür gibt es ein programm, damit kann man sogar namen schreiben, figuren zeichnen, ein bisschen rumspielen :)
dann wird das mica mit avidin inkubiert. das avidin legt sich genau in die zuvor gekratzten löcher hinein. man sieht den unterschied kaum, aber es sind dann einfach stellen mit unterschiedlicher struktur. dann inkubiert man mit virusfänger-ketten, an denen unten jeweils ein biotin dranhängt. das biotin bindet sich an das avidin, also nur dort wo zuvor löcher gekratzt wurden. dann wird das ganze mit schnupfenviren inkubiert. die viren hängen sich bei den fängern an. das sieht man dann super beim imagen.
das ganze braucht man dann für spätere experimente. wenn man z.b. das mica mit einer speziellen lösung wäscht, wird die äußere schleimschicht auf dem virus abgelöst. man sieht eine wabenstruktur. wäscht man das ganze mit einer noch aggressiveren waschlösung, geht die hülle auf und das informationsmaterial (rna/dna) des virus "fällt" heraus. es liegt nebenbei auf dem mica.

27.07.

wir haben unsere namen in proteinlayer gekratzt und danach ein 3d-bild davon produziert.


28.07.

andi ist wieder da!!!
ansonsten:
kurven auswerten.

es ist freitag. besonders viel ist heute nicht los. wir waschen die spitzen 3 mal in chloroform und trocknen sie anschließend mit stickstoff. dann cleaven wir die micas, das heißt, wir lösen mit klebeband einige schichten proteinlayer ab.

nachdem andi noch immer krank zuhause im bett liegt, mike im urlaub ist, und martina mit christina und moni spitzenchemie macht, bin ich heute bei philip, biacore messen.

der chip, mit dem wir messen, ist aus gold. darauf befinden sich zuckerketten, und darauf sind streptavidin-rezeptoren, die biotin binden. man funktionalisiert diese mit dna-strängen, an denen je ein biotin hängt.
die funktionsweise des biacore beruht auf der messung des brechungsindex. normalerweise wird ein laufpuffer kontinuierlich eingespritzt. das wird durch injektionen anderen materials unterbrochen.
zur vorbereitung des chips wird eine mischung aus nacl und naoh eingespritzt. die kurve, die man am computerbildschirm beobachten kann, zeigt die änderungen des brechungsindex an. wird nun die oben genannte mischung eingespritzt, geht die kurve (der brechungsindex) nach oben. endet die injektion, wird wieder laufpuffer eingespritzt. die kurve geht wieder nach unten. das ganze wird 3 mal durchgeführt.
(ein anstieg der kurve soll eigentlich zeigen, ob ein binding stattfindet. in diesem fall geht die kurve beinahe senkrecht nach oben, was zeigt, dass die laufflüssigkeit gewechselt wurde. bei einem binding geht die kurve rund und weniger steil nach oben und flacht ab.)
die chipoberfläche teilen wir in 2 hälften ein.
auf die eine seite spritzen wir mit speziellen fängern funktionalisiertes dna-material ein. unten an der dna hängt immer ein biotin, das soll an die streptavidin-rezeptoren binden. die kurve steigt wie erwartet an. aus der steigung der kurve könnte man zusätzlich noch die affinität berechnen (wie "gern" sich biotin und streptavidin binden).
danach lässt man wieder den laufpuffer drüber. der wäscht die ungebundene dna weg.
dann injiziert man imidazol (200mM). durch den sehr hohen brechungsindex steigt die kurve steil an. imdazol löst einen teil des dna-layers herunter. nach der injektion --> wieder laufpuffer.
dann kommt eine injektion anderen dna-materials, sozusagen das gegenstück zum dna-material mit fängern. man will zeigen, dass sich die funktionellen gruppen an der dna nur unter bestimmten umständen binden. nach zahlreichen unterschiedlichen versuchen, können wir diese theorie nicht bestätigen. eventuell interagieren die dna-stränge selbst miteinander. denn obwohl beide stränge negativ geladen sind und sich also abstoßen müssten, kann es sein, dass durch den hohen salzgehalt des puffers die ladungen maskiert werden und starke wechselwirkungen zwischen den strängen herrschen. um dies zu beweisen, machen wir einen neuen versuch. die funktionellen gruppen werden mit imidazol-injektionen abgelöst und durch gruppen ohne funktionellen anhang ersetzt. wenn die funktionellen gruppen trotz nicht angenommener umstände interagieren, dürfte man jetzt keine interaktion sehen. die kurve zeigt aber eindeutig eine interaktion. also kann es nur an den dna-strängen liegen. um auszuschließen, dass der chip kaputt ist (denn es könnte sich ja auch um eine interaktion zwischen chip und dna-material handeln), machen wir folgendes: nachdem wir wieder imidazol zum ablösen der dna verwenden, schicken wir das nicht funktionelle dna-material ohne bindungsstellen auf beide hälften des chips. die zweite, unbenutzte hälfte hat nur eine "nackte" proteinoberfläche. die kurve der ersten hälfte zeigt wieder eine interaktion, während die zweite kurve keine zeigt.
das sagt uns, dass es sich um eine interaktion zwischen den dna-strängen handelt und die theorie unter diesen umständen nicht bestätigt werden konnte.

21.07.

heute bin ich beim imagen mit jürgen. wir schauen uns die oberfläche von bestimmten komponenten auf glas an (ein sample in der nasszelle), dann wollen wir ein quadrat reinkratzen.
zuallererst: beim afm gibt es 2 verschiedene modi: den contact mode und den tapping mode. beim contact mode ist, wie der name schon sagt, die cantileverspitze ständig in kontakt mit der oberfläche. im tapping mode oszilliert der canti auf und ab, ein zweiter piezo oder ein magnet in der nose sorgen dafür, dass der canti zu schwingen beginnt. je höher die amplitude, desto niedriger ist die kraft, die benötigt wird. im tapping mode nimmt man meistens einen kleinen cantilever, der c-cantilever, der am größten ist, ist einfach zu träge für den tapping mode.
wir nehmen den f-canti im tapping mode.
zuerst bestimmen wir die frequenz: ca. 33kHz
dann sehen wir uns die kraft-abstands-kurve an. auf der y-achse ist die amplitude aufgetragen, auf der x-achse ist der abstand aufgetragen. wir erwarten eine kurve, die sich, je mehr man sich dem nullpunkt nähert, also je näher man an der oberfläche ist, nach unten biegt. man muss sich vorstellen: der canti oszilliert. trifft er auf einer oberfläche auf, wird die oszillation abgeschwächt, die amplitude wird kleiner.
und jetzt beginnen wir mit dem imagen, wir erzeugen ein bild der oberfläche (topografiebild). die kamera, die im mikroskop eingebaut ist, ist praktisch zum cantilever ausrichten. als erstes bekommen wir ein komisches bild. durch die kamera sehen wir, dass sich das sample mitbewegt, also brechen wir ab und nehmen das sample raus, vielleicht hat sich das klebeband, mit dem das sample in der nasszelle befestigt ist, gelöst.
wir starten einen neuen versuch.
beim imagen bekommt man immer 2 bilder: ein topografiebild und ein deflectionbild. (deflection ist das signal der reflexion des laserstrahls vom cantilever auf die photodiode. verbiegt sich der cantilever, verändert sich das signal.) das ziel ist, so viel information wie möglich vom deflectionbild ins topografiebild zu bringen.
über die gains kann man regeln, wie sensibel der piezo ist. stellt man die gains zu hoch ein, übersteuert der piezo und man bekommt kein bild.
wieder zurück zu unserem bild. das topografiebild ist verwischt. möglich, dass der canti noch nicht richtig in kontakt mit der oberfläche ist. neu einstellen.
das deflectionbild sieht hügelig aus, wir nehmen an, dass eine verunreinigung des samples oder der spitze vorliegt.
nach weiteren versuchen gibt es noch immer kein bild, also wird die spitze gewechselt.
schade, ich habe kein richtiges bild gesehen.
da schaut die lü vorbei. sie ist auch praktikantin hier, hat sich aber am fuß verletzt und kommt die ganze woche nicht. aber sie besucht uns heute.


22.07.

mein betreuer andi ist krank... gute besserung!
helfe moni beim kurven auswerten.