Im Rahmen der GEN-AU SummerSchool war Katja Krimsky von 3.7.-28.7.2006 in meinem Labor an der Klinik f. Innere Medizin I, Abt. Hämatologie & Hämostaseologie der MUW.
Frau Krimsky war sehr engagiert und interessiert, sowie sehr geschickt bei der Laborarbeit. Sie war etwas zurückhaltender im Vergleich zu unserem zweiten Gen-AU Schüler, Benjamin Panzer. Sie zeigte dennoch Stärken in der Kommunikation bezüglich theoretischer und praktischer Hintergründe und deren Erklärungen, was sich auch in einem guten Einvernehmen mit Herrn Panzer äußerte.
Weiters zeigte Frau Krimsky ein erstaunliches Erfassungsvermögen der komplexen Inhalte wissenschaftlicher Artikel.

Beide haben Theorie und Praxis ihrer Laborarbeit lebhaft diskutiert und in Teamarbeit das Protokoll für ihre Projekte verfaßt.

viele Grüße
Dr. Katrina Vanura

Ich möchte mich nochmals bei meinen Kollegen/Betreuern bedanken. Besonders bei Kathrina Vanura, Trang Le und natürlich Benjamin Panzer!!!

Es hat echt viel Spaß gemacht mit euch zusammenzuarbeiten!

LG Katja

Hallo allerseits!

Ich hatte am Freitag meinen letzen Tag im Labor. Da hieß es Abschied nehmen von netten Kollegen und auch von vielen interessanten Dingen die wir so gemacht haben.

An alle, die schon mit ihrem Praktikum begonnen haben bzw. die schon damit fertig sind - wie fandet ihr es? Habt ihr viel dazugelernt? Hat es eure Entscheidung eine Ausbildung, Studienrichtung etc. einzuschlagen beeinflusst?

Für mich persönlich hat es sehr viel genützt. Ich habe verdammt viel neues gelernt und habe auch einen Einblick in den Forscheralltag bekommen.
Für mich sthet leider noch immer nicht fest, ob ich Medizin oder Biotechnologie studieren möchte.
Ab September will ich eine Sanitäterausbildung beginnen. Falls irgendwer von euch sich auf dafür interessiert oder etwas zu meinem Bericht sagen möchte - schreibt mir bitte (cloudwalker@gmx.at)

Ich wünsch euch allen noch wunderschöne Ferien!

Hier habe ich für euch ein paar kurze Fakten über unsere Methoden und Experimente zusammengefasst:

Extraktion von DNA

Man extrahiert DNA aus Zellen um mit der reinen Form der DNA arbeiten zu können.
Die wichtigsten Punkte sind:

Ausgangsprodukt – Zellen

· Die Zellen mit PBS (phosphate buffered saline) oder NaCl (physiologische Kochsalzlösung) waschen damit das Medium in welchem die Zellen sind nicht mit der Arbeit mit der DNA interferiert.
· RSB puffer und RNAse dazu geben (dient dazu sie Zellwände auf zu brechen).
· Nach dem Inkubieren, TENS und Proteinase K hinzufügen damit die Proteine aufgespalten werden und wieder inkubieren.
· Abkühlen lassen, wieder NaCl (Aufreinigen) dazu mischen.
· Mit 100% EtOH ausfällen (DNA wird fest)
· Die DNA mit EtOH (70%) waschen und trockenen lassen.
· DNA in Wasser oder Puffer geben (Resuspension).
· DNA – Messung (in welcher Konzentration die DNA vorhanden ist).

Endprodukt – reine DNA
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PCR

PCR wird gemacht um DNA zu amplifizieren, zu klonen und um nachzusehen, wo sich ein bestimmtes Gen/DNA Sequenz befindet. Zuerst muss man die DNA extrahieren, und einen gewünschten Abschnitt mit Enzymen herausschneiden. Die DNA muss gefärbt werden damit man sie sehen kann und damit sie absinkt. und die Größe verschiedener Abschnitte anhand einenes ``ladders´´ zu messen. Danach muss man die DNA in ``wells`` in Agarosegel hinein pipetieren und eine Stromquelle anschließen. Die DNA wandert jetzt zur Anode.
Unter UV-Licht wird die ``ladder`` und die DNA sichtbar.

Diesen Beitrag ist vor allem all denjenigen gewidmet, die ihr Praktikum noch vor sich haben und sich noch nciht so ganz vorstellen können, was sie da alles erwarten wird.

Natürlich sind viele Experimente eine Routienearbeit und können auch oftmals enttäuschende Ergebnisse mit sich bringen. Wenn ich dabei an mich denke - also bei mir sind schon einige PCR-Screenings nichts geworden ... das ist aber oft nicht nur die Schuld des "Erschaffers" also von mir oder von euch, sondern der Grund kann auch wo anders liegen. Bei einer PCR können z.B. falsche Primer eingesetzt worden sein.

Nun gut, ich wollte ja erzählen, wieso es auch lustig sein kann im Labor. Abgesehen davon, das wir es mit spannender Materie zu tun haben (wir arbeiten wie gesagt im Bereich der Leukämieforschung) können solche Experimente auch lustig sein. Dazu tragen auch die teils witzigen Geräte bei die man so in einem Labor findet. Vortexer, Sequenzierplatten, Riesenzentrifugen und ein riesieger -80 °C Eisschrank. Oder habt ihr schon flüssigen Stickstoff gesehen - Vorsicht, bitte nicht mit bloßer Hand anfassen und Schut für die Augen ist auch sehr wichtig. Was mich ebenfalls sehr fasziniert hat war das "Füttern" von zellen. Auch Zellen haben Hunger.

Das einzige was uns allen nicht erspart bleibt ist die müsame Bürde jedes mal ein Protokoll zu schreiben. Das bleibt niemandem erspart.

Ich wünsche euch allen viel Spaß bei der Arbeit!!!

Wir haben die letzten Wochen damit zugebracht ein kleines Projekt durchzuführen. Zum Hintergrund dieses Projektes werde ich euch etwas später einiges mitteilen. Hier seht ihr ein Protokoll von den bis jetzt getätigten Aufgaben:



1. DNA Isolierung mit Proteinase K Verdau:

- Ausgangsprodukt: Zellen aus peripherem Blut einer gesunden Person
- 1 x 105 bis 5 x 107 Zellen mit NaCl (physiologische Kochsalzlösung) – damit das Medium in dem sich die Zellen befinden nicht mit der DNA interferiert
- Überstand abheben
- RSB-Puffer (400ml) und RNAse A (1ml) zum Pellet dazugeben à mischen (ohne Vortexer)
- 1 h bei 37 °C inkubieren (damit das Enzym wirkt)
- 400ml TENS-Puffer und 2ml Proteinase K hinzufügen
- auf 37 °C erhitzen – Inkubationszeit mind. 3 h (besser über nacht
- Lösung abkühlen lassen
- Aufreinigen mit 220ml 5M NaCl à gut mischen
- 10 min zetnrifugieren (13 000 U) à Proteinpellet bildet sich
- Überstand mit 2 mal so viel 100% EtOH fällen
- Tubes zentrifugieren (10 min, 13 000 U)
- DNA mit 70 % EtOH waschen, trocknen, lösen
- DNA in H2O geben (Resuspension)
- DNA – Messung der Konzentration im Photometer:
à einfüllen der DNA in eine Quarzbox
à Messung der DNA mit Licht bei einer Wellenlänge von 260nm und 280nm

Benjamin Katja
Ergebnis bei 260nm 0,07 0,48
Ergebnis bei 280nm 0,04 0,27
K= (OD(260) x 50 x Verdünnungsfaktor(20))/1000 70 ng/ml 48ng/ml
Qualität (Optimum = 1,7 – 2) OD (260)/ OD (280) 1,75 1,77

2. PCR

- Agarosegel (Pulver abwiegen – 1%ig), mit Puffer TAEIX mischen und kochen, abkühlen lassen und in einen Trax gießen
- Anfertigen des Lower Mix und des Upper Mix (es werden 2 Tubes gemacht + eine Negativkontrolle/ohne DNA)
- Lower Mix: Wasser mit Puffer, MgCl2, Dntp’s und den 2 Primern mischen
- Wachskügelchen in die Tubes füllen (trennen Lower Mix von Upper Mix)
- erwärmen auf °C
- einfüllen des Upper Mix (H2O, Puffer und Taq – im Falle von HOX11 +
5ml DMSO)
- Inkubieren
- Aufbrechen der Wachsschicht
- Gelkammer mit Puffer auffüllen
- Mix mit Orange G mischen und in die Wells einfüllen
- DNA-ladder-mix in ein Well einfüllen um später die Größe der DNA-Sequenzen messen zu können
- Stromquelle einschalten (man erkennt den Stromfluss anhand von kleinen Luftbläschen) – 30 Zyklen

4’ 94 °C
30’’ 94 °C
30’’ 50 °C
30’’ 72 °C
7’ 72 °C
Hold 4 °C

- Ausrechnen der Größe der DNA-Sequenz (HOX11, LMO2)
- Anschaun des PCR-Produktes unter UV-Licht
- Anhand der Ladder wird die Größe der DNA-Sequenz überprüft

3. GFX Aufreinigung

- Jeweils eine GFX-Säule in 4 Tubes hineingeben
- + 500ml capture buffer (nicht zu dicht an den Filter damit dieser nicht beschädigt wird)
- das PCR-Produkt in die GFX-Säule pipetieren
- Mischen
- Auf 14 000 U, 30s zentrifugieren
- Die Flüssigkeit die sich im Auffangröhrchen befindet weg schütten
- mit 500ml Waschpuffer aufreinigen
- Wieder 14 000 U, 30s zentrifugieren
- Das Auffangröhrchen wegschmeißen
- Die GFX-Säulen in ein 1,5 ml Microzentrifugetube einsetzen
- 50ml Elutionpuffer (H2O) hinzufügen
- Eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren
- Eine Minute bei 14 000 U zentrifugieren

4. Purifikation der DNA von Gelbanden

- DNA-Bande aus dem Agarosegel mittels eines Skalpels ausschneiden
- Das Gewicht des ausgeschnittenen Teilchens herausfinden
- 10 mal so viel capture buffer hinzufügen wie das Gewicht des Gels
- Vortexen und auf 60 °C inkubieren bis das Gel aufgelöst ist (5-15 min.,
zwischendurch vortexen)
- Inhalt in eine GFX-Säule leeren und kurz zentrifugieren
- Eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren
- Wieder 14 000 U, 30s zentrifugieren
- Die Flüssigkeit im Auffangtube wegschmeißen
- mit 500ml Waschpuffer aufreinigen
- Wieder 14 000 U, 30s zentrifugieren
- Das Auffangtube wegschmeißen
- Die GFX-Säulen in ein 1,5 ml Microzentrifugetube einsetzen
- 50ml Elutionpuffer (H2O) hinzufügen
- Eine Minute lang bei Raumtemperatur inkubieren
- um die purifizierte DNA zu bekommen zentrifugiert man und frau die
- Lösung 1 Minute lang bei 14 000 U

5. Ligation

- Ligation der PCR Produkte in den Vektor (Plasmid, in unserem Fall E.coli)
- Vector DNA (1ml), insert (7ml), Ligasepuffer (1ml), T4 DNA Ligase (1ml)
- auf 4 °C über Nacht inkubieren

6. Transformation

- Zellen auf Eis auftauen (kommen vom -80er) und immer auf Eis lassen
- 50ml von kompetenten Zellen (E.coli) dazu pepitieren
- Leicht flicken und 20’ auf Eis inkubieren
- Heatschock bei 42 °C exakt 2 min.
- 2 min. auf Eis stellen
- 500ml SOC dazu pipetieren (neben dem Feuer arbeiten da SOC ein Medium ohne Antibiotika ist)
- 1 Stunde auf den Schüttel-Inkubator stellen (37 °C)
- 5’ bei 5 000 U zentirfugieren, 300ml wegschmeißen
- Zellen auf Agarplatten übertragen
- auf 37 °C inkubieren (eine Nacht lang)

7. Transformation vom miniprep (erstes Mal)

Hinweis: immer neben dem Feuer arbeiten
- miniprep DNA 1:1 000 verdünnen
- 50ml JM109 Zellen hinzufügen
- 1ml dilution buffer dazu geben
- 20 min. auf Eis inkubieren
- Hitzeschock bei 42 °C für 2min.
- Wieder für 2 min. aufs Eis stellen
- 500ml SOC dazu geben und in die 13ml tubes mit lockerem Verschluss
- 1 Stunde bei 37 °C /225 rpm in den shaker stellen
- 200ml auf Amp-LB platten übertragen
- auf 37 °C inkubieren (16 Stunden)

8. Transformation vom miniprep (zweites Mal)

Hinweis: immer neben dem Feuer arbeiten
- 1ml DNA in Auffangtube mit GFX-Säule
- 50ml JM109 Zellen hinzufügen
- 1ml dilution buffer dazu geben
- 20 min. auf Eis inkubieren
- Hitzeschock bei 42 °C für 2min.
- wieder für 2 min. aufs Eis stellen
- 500ml SOC dazu geben und in die 1,5ml tubes pipetieren
- 1 Stunde bei 37 °C /225 rpm in den shaker stellen
- 200ml auf Amp-LB Platten übertragen
- auf 37 °C inkubieren (16 Stunden)

9. PCR Screening

- 10 tubes + 1 Negativkontrolle
- H2O (130,2ml)
- Puffer 5x (60ml)
- MgCl2 (12ml)
- dNTP’s (24ml)
- Primer 1 = P6B (36ml), Primer 2 = AF32 (36ml)
- Taq (0,15ml)
- template HOX11 bzw. LMO2 (bei Negativkontrolle -) à eine Kolonie mit der Pipettenspitze à am Rand reiben
- auf Eis lassen
- in die PCR Maschine (30 Zyklen insgesamt)

10. PCR Screening mit anderen Primern

Da unsere PCR vom Vortag nicht funktioniert hat haben wir diesmal andere (genspezififsche) Primer verwende:

HOX11 à HOX11 – 2B (Primer 1), OOP – 1B (Primer 2), DMSO (18ml)
LMO2,2 à LMO2,2 – 2B (Primer 1), OOP – 1B (Primer 2)

11. Maxiprep

Übernachtkultur
- 400ml LB Medium in eine sterile Erlenmeyerkolben füllen
- 400ml Ampicillin hinzufügen
- immer beim Feuer arbeiten
- eine E. Coli Kolonie mit steriler Pipette(nspitze) (vorher mit Isopropanol gewaschen) dazugeben
- über Nacht in den Shaker stellen
Ernte der Bakterien
- die Flüssigkeit in vier 50ml tubes schütten (wenns nicht rein passt ists egal)
- die tubes bei 5 000 U für 10 min. zentrifugieren
- Überstand verwerfen und umgedreht trocknen lassen
Alkalische Lyse und Proteinfällung
- Pellet in dem Cell Resuspension Solution (6ml/200ml Kultur) resuspendieren
- Cell Lysis Solution (6ml) hinzufügen und vorsichtig durch Umdrehen mischen
- 3 min. bei RT inkubieren
- Neutralization Solution (10ml) und wieder vorsichtig mischen
- 3 min. RT inkubieren
- bei 15 000 U 10 min. lang bei RT zentrifugieren (Proteinpellet bildet sich)
Binden der Plasmid-DNA and die Matrix
- Blaue (Clearing Column) auf weiße (Binding Column) Säule stecken und an die Vacuumpumpe anschließen
- Flüssigkeit (ohne Pellet) in die blaue Säule schütten
- Vacuum andrehen und abdrehen sobald keine Flüssigkeit mehr zu sehen ist
- blaue Säule wegwerfen
Aufreinigung
- 5ml Endotoxin Removal Wash Solution durch weiße Säule saugen
- 20ml Column Wash Solution -ll-
- Vacuum noch 30 Sekunden anlassen
Elution
- Die Binding Column abtrocknen und in ein neues 50ml tube stellen
- 600ml heißes (50-70 °C) Nuclease freies Wasser dazu pipetieren und 5 min. lang inkubieren
- bei 2 000 U, 5 min. lang zentrifugieren
- 5ml DNA mit 95ml H2O verdünnen
- Vortexen
- Messen der Konzentration im Photometer
- Restliche DNA auf 1mg/ml verdünnen

12. Ethanol-Ausfällung in tubes

- Stopsolution anfertigen und 5ml in 1,5ml tubes geben
EDTA 0,1M pH 8,0 2ml/tube
Na-Acetate 3M pH 5,2 2ml/tube
Glycogen (20mg/ml) 1ml/tube
- Sequenzreaktion dazu pipetieren
- gut mischen
- 60ml 100%iges kaltes EtOH dazu geben und mischen
- 15min. bei 4 °C 14000U zentrifugieren
- Überstand los werden
- 200ml 70%iges kaltes EtOH
- 2min. bei 4 °C 14000U zentrifugieren
- Überstand los werden
- 200ml 70%iges kaltes EtOH
- 2min. bei 4 °C 14000U zentrifugieren
- Überstand los werden
- Im Thermoblock 5min. lan bei 37 °C trocknen lassen
- 40ml SLS dazu geben und 10min. inkubieren
- Pellet resuspendieren
- in eine Sequenzierplatte übertragen

13. Ernten von Zellen

- Enzym Trypsin zu den Zellen dazugeben àlösen sich von der Oberfläche
- 3 min. bei 37 °C erwärmen
- Inaktivierung durch die Zugabe von 5 ml zellspezifsches Medium
- in 50 ml Falcons pipetieren
- Platte mit PBS auswaschen
- PBS dazugeben und 7 min bei 1200 U, 4 °C zetrifugieren
- Überstand abheben und das Pellet resuspendieren
- 2 x 550ml PBS à überführen in Eppendorf-tubes
- 7min bei 1200 U, 4 °C
- Überstand abheben und das Pellet in 100ml kalter Sol I resuspendieren (auf und abpipetieren
- 200ml frisch angefertigte Sol II dazugeben
- mischen durch Invertieren à 5min. auf Eis legen
- 150ml kaltes Sol III hinzufügen und durch Invertieren mischen à 30min umgedreht auf Eis legen
- 15min bei 14 000 U, 4 °C zentrifugieren
- den Überstand in phase-lock gel tubes pipetieren
- 1 phenol/chlo Extraction
- prezipitieren mit 1ml Glycogen + 45ml NAAC + 900ml Ethanol 100%ig
- für 20min bei –80 °C abkühlen lassen
- für 15min bei 14 000 U, 4 °C zetrifugieren
- 2 mal mit 70%igem Ethanol (500ml) waschen
- Ethanol abpipetiren und kurz (2min) im Thermoblock trocknen lassen
- Verdauung: 17ml H2O
- 10 min bei 65 °C erwärmen und vortexen

Solution I:
0,9 g Glucose
2,5 ml Tris 1 M PH 8
2 ml EDTA 0,5 M
QSP 100 ml H2O

Solution II:
200ml NaOH 1 N
100ml SDS 10%
700ml H2O

Solution III:
3 M Kac PH 4,8
Eisessig

13. Verdauung

DpnI:
17ml DNA
2ml Tango Puffer
1ml DpnI (10 U) à bei 37 °C 1 h inkubieren

- 70ml H2O, 10ml NaAc und 250ml EtOH 100%ig
- 1 mal mit 70%igem EtOH auswaschen (500ml)
- Überstand abheben
- Pellet im Thermoblock 5min bei 37 °C trocknen lassen
- das Pellet in 10ml Wasser resuspendieren
- 20min bei 65 °C erwärmen und mischen (flicken und vortexen)

14. Transformation durch Heat Shock (Top 10 Zellen)

- 10ml (eigentlich viiiiiel zu viel – ideal sind 1 oder 2ml) DNA zu den Zellen transferieren
- 30 min auf Eis inkubieren
- Heat Shock à 30 sec 42 °C à 2 min auf Eis
- 300ml SOC Medium hinzufügen (beim Feuer arbeiten)
- 1 h im Schüttelinkubator bei 225 U und 37 °C
- auf Amp50/Chlo5 Platten

15. PCR Screening

- 11 tubes + 1 Negativkontrolle (LMO2,2) bzw. 4 tubes + 1 NK (HOX11)
- H2O (10.85ml)
- Puffer 5x (5ml)
- MgCl2 (1 ml)
- dNTP’s (2 ml)
- Primer 1 = P6B (3 ml), Primer 2 = AF32 (3 ml)
- Taq (0,15ml)
- template HOX11 bzw. LMO2 (bei Negativkontrolle -) à eine Kolonie mit der Pipettenspitze à am Rand reiben
- auf Eis lassen
- in die PCR Mas

WIE ALLES BEGONNEN HAT ...

Da ich derzeit eine HAK besuche, hatte ich mir niemals gedacht, dass ich eine Chance bekommen würde bei einem Praktikum bei Genau mitzumachen. Meine Biolehrerin machte mir dennoch den Vorschlag es zu probieren.
Und siehe da, ich habe es tatsächlich geschafft :)

Meine Betreuerin heißt Katrina Vanura (eigentlich Fr. Dr. !!!). Ich arbeite zusammen mit Benjamin Panzer (bitte net bös sein, dass ich dich auch mal erwähnt habe).
Unser Arbeitsplatz ist im AKH und wir beschäftigen uns mit der Krebsforschung - genauer gesagt ist unser Thema vor allem wie sich die Trankslokation von Genen bei einem Rearrangement von Antigenrezeptoren auf die Entwicklung von Krebs austrägt.


DAS WAREN MEINE AUFGABEN BIS JETZT:

Als erstes möchte ich sagen, dass ich schon jetzt um einiges schlauer geworden bin. Ich habe sehr viel neues gelernt. Bis vor kurzem hatte ich zum Beispiel keine Ahnung, was ein TCR oder eine PCR ist.

Als ich am ersten Tag ins AKH fuhr, wusste ich trotz Vorstellungsgespräch nicht wirklich, was mich erwartet. Ich war total aufgeregt und hatte ein bisschen Angst, dass ich nicht gescheit genug für so ein Praktikum wäre - wer weiß, vl würden die mich ja doch zurückschicken (haben sie bis jetzt noch nicht gemacht *gg* - danke!!!). Aber das war unbegründet. Die Kollegen im Labor sind alle sehr freundlich, das ist sehr hilfreich wenn man sich unsicher fühlt.

Zuerst wurden wir in die Grundregeln des Laboralltags eingewiesen und machten uns ein bisschen mit den Geräten im Labor bekannt. Wir durften auch schon ein Agarosegel gießen bzw dabei helfen.

Am zweiten Tag haben wir mit Herrn Dr. Hubmann die Theorie des PCR durchgenommen. Ebenso haben wir einiges über NOTCH2 gehört (so wie auch den Spruch: To be or NOTCH2 be *gg*).

Der dritten Tag war auch sehr spannend. Wir haben gelernt wie man einen vortexer und ein Zentrifugiergerät benutzt. Außerdem wurden wir mit der Aufgabe betraut uns über den Leukämievirus schlau zu machen.

Am vierten Tag durften wir DNA ISOLIEREN!!! Das war echt aufregend.

Der fünfte Tag war für mich der beste überhaupt. Wir durften selbst eine PCR (Polymerase chain reaktion) durchführen. Natürlich hat nicht alles gleich auf Anhieb geklappt, aber das macht ja nichts - aus Fehlern lernt man ;)