Heute war schon der letzte Tag von meinem Praktikum, und wir haben unseren eigenen Versuch beendet. Zunächst haben wir aber noch eine andere Probe (Membran) für den Westernblot gestrippt. D.h wir haben sie mit Puffern und einer Blockierungslösung gewaschen, dadurch werden die verwendeten Antikörper abgewaschen. So es ist möglich, die Membran mit anderen Antikörpern zu behandeln und den Versuch auf andere Proteine zu untersuchen.
Dann haben wir erstmal zum Abschied mit allen unseren mitgebrachten Kuchen gegessen und gemütlich Pause gemacht.
Am Nachmittag haben wir dann unseren eigenen Westernblot durchgeführt und ausgewertet(Membran gewaschen, gescannt und am Computer ausgewertet). Wir haben dieses Mal auch selbstständig am Computer die Auswertung vorgenommen. Dazu markiert man die Banden auf dem gescannten Abbild der Membran und das Programm berechnet die Intensität und kann somit auf die Menge der Proteine schließen.
Ebenfalls haben wir heute noch unsere Proben für den CAT fertig bearbeitet. Dabei wird ein Spaltprodukt eines Enzyms radioaktiv markiert und somit geprüft ob die Transfektion erfolgreich war. Vorher haben wir vom Professor noch eine Einweisung zum arbeiten mit radioaktiven Substanzen bekommnen.
Die Strahlung der Proben wird im ß-Strahler gemessen und somit die Enzymkonzentration ermittelt.
Danach war für uns der letzte Tag auch schon vorbei.:(
Insgesamt war es eine sehr schöne Zeit und eine tolle Erfahrung, vor allem durch den netten Umgang und die freundliche Atmosphäre im Labor. Zusätzlich hat man sich viel Zeit für uns genommen und sich viel Mühe gegeben. Ich habe in den drei Wochen wirklich viel Neues gesehen und gelernt und es war alles eine sehr abwechslungsreiche und spannende Zeit. Jetzt werde ich mit Tina noch unser letztes Wochenende in Innsbruck genießen und mich dann mit ihr am Montag auf die Heimreise begeben.;) Die drei Wochen sind jetzt doch relativ schnell vorbei gewesen.;(

Der vorletzte Tag ist nun auch schon vorbei. Wir haben am Vormittag unsere Zellen geerntet und sie mit verschiednen Puffern auf den Westernblot vorbereitet. Nach dem wir die Gelkammer aufgebaut und mit Proben befühlt hatten, haben wir während der Westernblot lief schon die Proben für den CAT vorbereitet. Die Proteinverteilung auf dem Gel haben wir dann auf eine Membran geblotet und diese werden wir morgen auswerten.
Am Nachmittag haben wir die Membran eines anderen Westernblotdurchgangs selbständig auf das Scannen vorbereitet, dazu sind Zugaben verschiedener Antikörper und mehrere Waschgänge notwendig. Nach der Vorbereitung auf das Scannen, wurde dieses auch noch erfolgreich durchgeführt und die Ergebnisse auf dem Computer analysiert.
Zwischen den ganzen Inkubation- und Waschzeiten haben wir noch beim Gewinnen von cDNA aus RNA zugeguckt.
Morgen steht dann die Auswertung das Scannen und Auswerten unserer Membran an. Außerdem werden wir mit unseren Zellen noch einen CAT machen.

So heute haben wir zunächst selbstständig die Proben für den Westernblot fertig gestellt.

Dazu haben wir verschiedene Puffer und Substanzen zu dem Überstand der abzentrifugierten Zellen gegeben. Um die enthaltene Proteinmenge zu ermitteln haben wir mit den Proben eine Photometermessung durchgeführt und die Proben dazu in Küvetten gefüllt. Nach der Messung haben wir am PC die notwendigen Konzentrationen für die Westernblotproben berechnet. Wie letzte Woche haben wir wieder die Gelkammmer für den WB zusammengebaut und den notwendigen Puffer hinzubegeben.
Unter Aufsicht haben wir dann die sehr kleinen Probenkammern der Gelschicht befühlt, was wirklich sehr schwierig ist. In der Gelkammer entsteht dann ein elektrisches Feld und die Proteine werden aufgetrennt.
Am Nachmittag wurden die Ergebnisse der Gelschicht auf eine Membran übertragen, die wir morgen weiterbearbeiten werden und danach auswerten können.
Natürlich haben wir heute auch weiter an unserem eigenen Versuch gearbeitet, leider haben wir bemerkt, dass in einigen wells viele Zellen aufschwimmen (ein Zeichen dafür, dass sie abgestorben sind). Trotzdem haben wir die Zellen wie geplant, heute mit Hormonen stimuliert. Mit unserem Versuch möchten wir nämlich erforschen, wie ein bestimmtes Protein die Androgenrezeptorexpression fördert.
Morgen werden wir die Membran des Westernblots auswerten und mit unserem eigenen Zellen ebenfalls einen Westernblot durchführen.

Der Tag heute fing entspannt an und wir sind erst gegen halb elf im Labor gewesen. Dort angekommen ging es aber auf Grund einer Feier nicht direkt los mit arbeiten. Nach einem leckeren Essen und netten zusammensitzen haben wir am Nachmittag nur noch Proben für einen Westernblot vorbereitet und natürlich an unserem eigenem Versuch weitergearbeitet. Bei diesem haben wir die Transfekton durchgeführt, das heißt die verschiedenen Plasmide zu unseren Versuchszellen gegeben. Morgen werden diese mit Hormonen stimuliert.

Die letzte Woche hat nun begonnen, wir werden die gesamte Woche einen eigenen Versuch unter Aufsicht ausführen. Diese letzten Tage verbringen wir zu dritt, d.h Tina, Juliana (ebenfalls SummerSchool) und ich. Wir werden Zellen zunächst aussäen, dann transferieren und mit Hormonen stimulieren. Die Ergebnisse werden mit verschieden Methoden, dem so genannten Westernblot und einem CAT ermittelt und ausgewertet.
Heute haben am Vormittag zugesehen, wie RNA aus Zellen isoliert wird, dazu sind verschiedene Puffer und Waschschritte notwendig. Am Ende werden die Proben in Röhrchen zentrifugiert. Die Röhrchen werden in der Mitte durch eine Membran getrennt, an dieser bleibt die RNA „hängen“ und kann somit isoliert werden. Am Nachmittag waren wir dann noch bei einer Messung der Qualität und Quantität der RNA dabei, dazu wurde ein Photometer verwendet.
Zusätzlich haben wir für unseren eigenen Versuch noch die Zellen ausgesät und haben diese in die 6well und 24well-Platten gegeben.

Wie gestern schon erwähnt, haben wir den heutigen Tag auf der analytischen Chemie verbracht. Hier findet die so genannte Grundlagenforschnung statt, das heißt es werden Methoden für die Forschungslabore erprobt.
Ich habe heute mit Tina und zwei anderen Praktikanten das Massenspektrometer und seine Arbeitsweisen und Funktionen kennen gelernt. Besondere Aufmerksamkeit liegt auf der Bestimmung und Separation von Proteinen, die als Tumormarker dienen könnten. Das Massenspektrometer kann die Masse von Molekülen bestimmen. Dazu gibt man die zu untersuchenende Probe auf ein Target (Metallplatte zum daraufpipettieren) und versetzt diese mit einer Säure die als Matrix dient. Die Säure, als Protonendonator, gibt Protonen an die Moleküle ab, wenn ein Laser auf die Probe trifft. Dadurch werden diese zu Ionen und gehen gleichzeitig in den gasförmigen Zustand über. Die Ionen werden mit Hilfe eines elektrischen Feldes beschleunigt und durch einen Filter auf einen Detektor geeignet. Der "Filter" sortiert die Moleküle nach Größe, so dass der Detektor in der Lage ist anhand der Geschwindigkeit die Masse der Moleküle zu bestimmen.
Später haben wir selbst Proben für eine Massenspektroskopie hergestellt, was mit viel pipettieren, zentrifugieren und inkupieren zu tun hatte.:)

Diesen Tag haben wir im Routinelabor verbracht, diese ist hauptsächlich für PSA und Hormon-Analysen zuständig. Hier kommen täglich Proben, meistens Blutproben an, die dann auf den PSA- oder bestimmte Hormongehalte untersucht werden. Die größte Teils der Blutproben werden im Rahmen des Tiroler Prostatakarzinom- Screeningprogramm auf PSA-Werte untersucht. Denn ein erhöhter PSA-Gehalt ist ein Hinweis auf ein Prostatakarzinom. Die angekommenen Blutproben werden dann zunächst abzentifugiert und in Röhrchen aufbewahrt, die eine Gelschicht in der Mitte des Röhrchens bilden und ein Vermischen der aufgetrennten Blutbestandteile verhindert.
Mit Hilfe von Antigen-Antikörper-Reaktionen werden die Proben untersucht, dabei kann werden verschiedene Markierungsarten, wie zum Beispiel radioaktive Substanzen verwendet.
Dann haben wir selber noch eine RIA-Test durchgeführt, bei dem mit einer radioaktiven Markierung gearbeitet wird, somit ist ein GAMMA-Strahlenmessgerät später dazu in der Lage die Intensität der Strahlung zu messen und somit die Konzentration, in unserem Fall DHEAS, zu berechnen.
Wir hatten noch die Gelegenheit zu sehen, wie sie weißen Blutkörperchen aus dem aufgetrennten Blut separiert werden und dann eingefroren werden, um aus ihnen später DNA und RNA zu gewinnen.
Danach haben wir noch eine Einführung in das System der Biodatenbank erhalten, in dieser werden alle Informationen über die Proben (Gewebe, Plasma, Serum und Harn)gespeichert. Da alle untersuchten Proben auch für Forschungszwecke seit 1992 aufbewahrt werden, ist auch der Lagerort der jeweiligen Probe dort gespeichert. Die Proben können so bei Bedarf im Lager geholt werden und stehen für Forschungsprojekte zur Verfügung. Diese Datenbank ist eine der größten in Europa.
Morgen werden wir unseren Tag in der analytischen Chemie verbringen.