Gestern und heute haben wir hauptsächlich an unserem Westernblot gearbeitet. Das ist sowas ähnliches wie die DNA Analyse nur wird damit nicht die DNA sondern die Proteine sichtbar gemacht. Genau wie bei der DNA Analyse wird für diese Analyse auch ein Gel benötigt, nur liegt es nicht waagrecht wie bei der DNA Analyse und ist aus zwei Schichten aufgebaut. Das untere Gel nennt sich Trenngel und das obere Sammelgel. Das Sammelgel ist leicht zu "durchdringen" und dadurch wird es von den Proteinen schnell durchlaufen, welche dann an der Grenze zum Trenngel "gestoppt" werden. Unsere Proben haben wir in einem Lemlybuffer gelöst, eine blaue gefärbte Flüssigkeit mit Glycerin und einigen anderen notwendigen Chemikalien. Das Gel haben wir in einen dafür vorgesehen Behälter gegeben und mit Elektrophoresepuffer umschüttet, welcher dazu da is die elektrische Spannung zu leiten.
Dann haben wir den Proben einen Hitzeschock mit 95°C verpasst und sie somit denaturiert. Danach haben wir die Proben auf das Gel aufgetragen und ein bisschen mehr als 2 Stunden an der elektrischen Spannung angehängt.
Danach folgte der eigentliche Aufbau des Blotts. Zwischen eine Kathode und Anode gibt man jeweils einen Schwamm, 2 Whatman Filterpapierblätter, dann das Gel und eine Hybond-Membran. Die Proteine von dem Gel übertragen Insich auf diese Membran durch elektrische Spannung.
Nach circa 2 Stunden ist die Membran fertig und als nächstes wird sie in einen sogenannten Blotto auf der Wippe inkubiert. Der Blotto besteht im wesentlichen aus Milchpulver und Tween 20, einer honigartigen Flüssigkeit.
Danach haben wir die Membran mit dem ersten Antikörper inkubiert und wieder auf die Wippe gestellt.

Danach haben wir die Membran "gewaschen".

Infolge dessen haben wir sie dann noch mit dem 2. Antikörper inkubiert und wieder auf die Wippe gestellt.

Die Membran haben wir dann in eine Art Frischhaltefolie verpackt und einen Indikator hinaufgeklebt, damit wir nachher die Unterteilungen ablesen konnten.

Danach sind wir in die Entwicklungskammer gegangen und haben als erstes Fotofolie mit den Proben belichtet und sie dann in Entwickler, Fixierer und Wasser eingelegt. Danach hatten wir schöne "Bilder" unsrer Proteine.

Am Schluss unsres heutigen Tages haben wir noch unsre Klone gepickt, das heißt eine Pipetierspitze genommen und in große Zellen "hineingetaucht". Diese Spitzen haben wir in eine speziellen Nährflüssigkeit eingelegt, damit sich die Zellen wohlfühlen und sich vermehren.

Als nächstes werden wir die DNA dieser Zellen heraussequenzieren.

Heute haben wir zum ersten Mal "kloniert". Das heißt wir schneiden aus einem Zellring eine Sequenz heraus und versuchen diese dann in einen anderen Ring einzufügen. Dazu haben wir die Zell DNA so präperiert, dass genau diese Sequenz auf einer bestimmten Höhe liegt. Nachdem wir dann diese DNA auf ein Gelpolster aufgetragen haben, konnten wir mit einem Skalpell genau diese Sequenz herausschneiden. Danach haben wir dieses Gelstück in einer Flüssigkeit wieder geschmolzen und dann mit einem speziellen Kit wieder die DNA herausgeholt. Vorher haben wir dazu eine Reinigungsflüssigkeit hineingegeben und in die Zentrifuge gegeben, danach das gleiche nochmal durch den Filter gelassen, und dann mit einigen anderen Flüssigkeiten wieder verdünnt und nach jedem Schritt wieder in die Zentrifuge gestellt. Genau das gleiche haben wir dann auch mit dem zweiten Ring gemacht.

Als erstes haben wir die Gelpolster vorbereitet in die wir dann die vorbereiteten DNA Proben gespritzt haben, danach haben wir die Gelpolster unter Strom gesetzt, wodurch das ganze zu wandern anfing. Nach knapp über einer Stunde konnten wir dann die ersten Ergebnisse unter UV-Licht betrachten. Leider war bei unsrer "Buffer-Only" Probe auch was zu sehen, das heißt dass einer der Primer das Ergebnis verfälscht hat. Somit war das Ergebnis unbrauchbar.
Also machten wir mit dem zweiten Gelpolster mit den neuen Proben weiter. Gottseidank war dieses Mal bei Buffer-Only nichts zu sehen und auch die restlichen Proben haben ganz gut ausgesehen.
Zum Schluss haben wir noch einmal die Zellen vom ersten Tag hergenommen und sie hatten sich ganzschön vermehrt. Wir haben einen von diesen "Punkten" mit einer Pipetierspitze herausgenommen und in eine weitere Nährlösung gelegt, die aber jetzt flüssig und mit Antibiotikum versetzt war. Dadurch sollte das Wachstum weiter angeregt werden, da sich die Zellen in Flüssigkeiten noch besser ausbreiten können. Durch das Antibiotikum sollten alle Zellen die nicht mit der DNA versetzt waren noch zusätzlich absterben.
Morgen werden wir daraus eine Dauerkultur anlegen und diese dann einfrieren.

Am nächsten Tag waren unsere Mäuseschwanzstückchen aufgelöst und es waren nur mehr vereinzelt Haare zu sehen. Als nächsten Schritt haben wir sie jetzt gevortext, das heißt kräftig durchvibriert. Danach haben wir sie für 5 Minuten bei 13.000 Umdrehungen in eine Art Zentrifuge gegeben, damit sich die Härchen und Proteine unten absetzen. Danach haben wir von jeder Probe 350 Mikroliter weggenommen und in andere Epis umgefüllt, die ebenfalls mit den entsprechenden Nummern gekennzeichnet waren. Dadurch bleiben noch 150 Mikroliter in den alten Epis zurück, welche später weggeworfen werden, wir jetzt jedoch noch aufheben falls irgendeine von den anderen Proben ausrinnt oder ähnliches.
Zu den 350 Mikroliter haben wir jetzt jeweils 350 Mikroliter isopropanol, also Alkohol hinzugegeben und wieder 5 Minuten in die Zentrifuge gestellt. Da dieser Alkohol nicht vollständig verdampft, haben wir ihn wieder ausgeleert, die DNA klebte inzwischen an dem Epi und so konnten wir es ohne Probleme ausleeren.
Im Anschluss haben wir es mit 70%tigen EtOH "gewaschen", das heißt eingefüllt, zentrifugiert und wieder ausgeleert. Danach haben wir es im Vakuum für ein paar Minuten trocknen lassen. Dann haben wir wieder 150 Mikroliter TE hinzugefügt und bei 55°C eine halbe Stunde gelassen.
Für die PCR Reaktion braucht man davon jeweils nur 1 Mikroliter.

Als nächstes haben wir die Flüssigkeit für die PCR-Reaktion vorbereitet. Sie enthält Freseniuswasser, ein mehrmals destiliertes und dadurch sehr sehr sauberes Wasser, Buffer, Nukleotide und Enzyme. Außerdem noch zwei Sorten von Primer, der für die Sichtbarmachung des Mutanten bzw. Wildtypgens zuständig ist. Weiters noch 1 Mikroliter der DNA.
Wir haben die ersten 19 Proben damit "zubereitet" und außerdem noch eine negativ und eine positiv Probe und eine Probe nur mit Buffer. Das ist dazu gut, um zu sehen ob die Ergebnisse auch wirklich richtig und nicht fälschlicherweise Informationen beispielsweise von dem Buffer kommen.
Diese Proben werden nun einem bestimmten Temperaturprogramm unterzogen. das heißt als erstes 3 min bei 94°C und dann 35x 94°C für 30 Sekunden, 62°C für 1 Minute, 72°C für 1 Min, am Schluss noch 72°C für 2 Minuten und dann 10°C.

Gestern war also mein erster Tag an der Naturwissenschaftlichen Fakultät in Salzburg.
Als erstes hat mich mein Betreuer Markus in die Grundweisheiten des Pipetierens eingewiesen, was sich als sehr lustig herausgestellt hat.
Im Anschluss haben wir auch sofort das erste Experiment gestartet. Es ging darum, Zellen mit einer DNA zu versehen. Als erstes haben wir die Zellen aus dem -70°C kalten Tiefkühler genommen und wieder auf Eis gelegt, damit die Zellen nicht zu schnell auftauen, was wir verhindern wollten, da die Zellen nur in einem bestimmten Entwicklungsphase die DNA aufnehmen. Nachdem die Zellen aufgetaut waren haben wir die DNA hinzugefügt und 30 Minuten wieder auf Eis gelegt und ihnen danach einen Hitzeschock mit 42°C verpasst, weil sie sich damit sozusagen "erschrecken" und die DNA so besser aufnehmen, nach dem Hitzeschock haben wir sie wieder 2 Minuten auf Eis gelegt.
Als letztes haben wir sie auf Platten ausgebreitet und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Nach der Mittagspause ging es dann weiter mit der Mausgenotypbestimmung.
Als erstes haben wir die "Schwanz" DNA vorbereitet. Dazu haben wir die Schwanzstückchen iin einen speziellen Extrationsbuffer eingelegt und schließlich noch Protein K in Wasser hinzugefügt.
Das war auch schon wieder das Ende des Tages, denn diese Proben mussten über Nacht "ruhen".