Methoden / Experimente
14:41 / 22.06.2010
Ich werde in den nächsten Wochen hauptsächlich mit dem AFM (Atomic Force Microscope) arbeiten, das nach dem Prinzip der Rezeption (also z.B. von Rezeptor und Ligand) funktioniert.
Dabei befinden sich Cantilevers (Spitzenförmige Balken) an den Rändern eines VEECO-Plättchens. An den Cantilevers nochmal befinden sich nanometergroße Spitzen, woran je ein gummibandähnlicher PEG-linker, der als Feder dient, und daran wiederum je ein Ligand befestigt. Mit den Cantilevers werden Oberflächen abgetastet.
Durch Reflexion auf vier Fotodioden, wobei die Differenz den Auftreffpunkt des Cantilevers angibt, entstehen Bilder am Computer. Ertastet der Cantilever eine Hebung / Senkung, kommt es natürlich durch Verschiebung zu einer Reflexion als bei einer glatten Oberfläche.
Es kann aber auch vorkommen, dass Rezeptor und Ligand sich verbinden. Um diese Verbindung zu lösen, muss der Cantilever mit enormer Kraft von der Oberfläche weggerissen werden. Mit einem Ruck saust also der Cantilever nach oben, was wieder ein spezielles Bild am Computer ergibt. (graphisch beim Ziehen eine halbkreisförmige Verschiebung und dann im sog. "unbinding moment" eine gerade Linie nach oben)
Gestern hatte ich die Aufgabe, diese "unbinding moments" mit dem Programm MATLAB in jewweils 1000 gemessenen Bildern zu markieren.
Was ich bis jetzt so gecheckt habe, verwendet man das AFM zur Messung der Verschiebung und zur Messung der Kraft, die für den "unbinding moment" nötig ist. Dabei gilt das Hooksche Gesetz, das wir ja irgendwie schon mal gelernt haben ;) F=delta z * k
delta z ... Verschiebung
k.... Spring Constant (Federkonstante)
14.7.10 - Heute haben wir mit dem MAC-Cantilever gearbeitet. Der Unterschied zum normalen Cantilever ist dabei, dass der MAC-Cantilever statt Abtastbewegungen auf und ab gehende Klopfbewegungen macht. Diese Bewegungen entsprechen Schwingungen. Die beste Amplitude ergibt sich dabei aus der Eigenfrequenz des Cantilevers, die man gleich am Anfang am PC herausfinden will. Natürlich kann es auch sein, dass der Cantilever zu hart auf die Oberfläche aufklopft und dabei beschädigt wird. Deshalb ist es der nächste Schritt, den Cantilever schrittweise an die Oberfläche anzunähern. Der Moment, in dem er aufkommt, ist erkennbar durch eine ruckartige fallende Linie nach unten. Was wir im Versuch mit alex und Andi herausfinden wollten, war die durchschnittliche Anzahl an Proteinen in Lipiden und ihren Höhenabstand zu den Lipiden. Lipide sind Zellhäute, Fette. Sie bestehen aus Kopf- & Schwanz - Doppelpaaren, wobei der hygroskopische Kopf in Richtung der Zellflüssigkeit orientiert ist. Proteine sind in Lipide eingebaut und ragen an der Oberfläche heraus, also liegen höher als die Lipide.
Mit Andreas wollten wir mit dem MAC-Cantilever ein Loch aus einer Oberfläche "heraushacken", was irgendwie auch über Tiefe und Dichte eines Stoffes aussagt. Das Loch war am Bild schwach erkennbar, aber leider haben wir den Cantilever zerstört - die Peaks - sanfte Stocherungen - waren nicht sanft genug ;)
19.7.
Heute haben wir einen Cantilever mit dem AFM untersucht. Der Cantilever besteht aus Silicium-, Chrom- und Goldschichten (Gold zum Reflektieren der Cantileverbewegungen fürs Computerbild und Chrom als Beschichtung, damit Gold haftet). Durch das Zusammenwirken dieser Stoffe kann es zur Verbiegung des Cantilevers kommen.
Weiters habe ich noch Details über die verschiedenen Modi erfahren. Beim Mac-Mode und beim Tapping-Mode versucht das AFM die Amplitude des Cantilevers konstant zu halten. Beim Mac-Mode ist es also die Kunst, dass die Bindung von Rezeptor und Legand nicht abreißt, also sich der Cantilever nach der Störung wieder einpendelt. Der Unterschied zwischen Mac-Mode und Tapping-Mode ist, dass beim Mac-Mode die Bewegung des Cantilevers magnetisch angeregt wird und beim Tapping-Mode akkustisch. Beim Contact-Mode versucht das AFM die Verbiegung des Cantilevers konstant zu halten, beim Abtasten der Oberfläche kommt es also zur Topografie-Änderung am Computerimage oder zu einer kurzen Störung beim Abriss einer Bindung. Heute, zum Beispiel, die Bindung von Streptavitin und Biotin an der DNA.
Zum Schluss habe ich dann noch die Flüssigkeit zum Lipide Messen gereinigt. Die Lipide, die an der Oberfläche schwimmen, könnten an den Spitzen kleben bleiben. Daher haben wir sie mit einer Pipette abgesaugt und gleichzeitig mit einer anderen wieder Flüssigkeit nachgefüllt - darf nicht austrocknen.
20.7.10
Heute bin ich mit Babsi in einem gespenstisch langen weißen Kittel ins Chemie-Labor gejoggt und habe 100 mg einer Linker-Flüssigkeit abgefüllt. Der Linker (mPAG thiol, wobei thiol eine SH-Gruppe ist) wird an den Spitzen angebracht. Dabei haben wir 100 mg Linker-Flüssigkeit abgewogen, in ein Döschen gefüllt, mit Argon duch Beblasen den Sauerstoff verdrängt (Argon ist schwerer als Luft, sinkt zu Boden und verdrängt die Luft) und das Döschen mit Hilfe einer Krimp-Zange fest verschlossen. Anschließend beschriftet, in ein noch größeres Gefäß mit Silica-Gel gegeben (das blaue Silica-Gel saugt Flüssigkeit auf und verfärbt sich rosa - durch Erhitzen wird es wieder blau) und wieder verschlossen. :)
Dann habe ich mit Isa weiter die Bindung von Trombin und Aptamer ausgearbeitet. Dabei hat mir Andreas erklärt, dass es auch grundsätzliche Schwingungen gibt, alleine durch Tempertatur und die Geräuschkulisse - deshalb sind in unseren Bildern dauerhafte Schwingungen des Cantilevers. Eine andere Störung, die nicht mit einem tatsächlichen unbinding moment verwechselt werden darf, ist die Adhäsion. Schon auf natürliche Weise bleiben Spitze und Oberfläche manchmal aneinander kleben, binden sich aber nicht. Der Abriss davon sieht ähnlch aus wie ein unbinding moment, der Cantilever verbiegt sich dabei aber nicht langsam, sondern reißt gleich von der Oberfläche weg.
Dabei befinden sich Cantilevers (Spitzenförmige Balken) an den Rändern eines VEECO-Plättchens. An den Cantilevers nochmal befinden sich nanometergroße Spitzen, woran je ein gummibandähnlicher PEG-linker, der als Feder dient, und daran wiederum je ein Ligand befestigt. Mit den Cantilevers werden Oberflächen abgetastet.
Durch Reflexion auf vier Fotodioden, wobei die Differenz den Auftreffpunkt des Cantilevers angibt, entstehen Bilder am Computer. Ertastet der Cantilever eine Hebung / Senkung, kommt es natürlich durch Verschiebung zu einer Reflexion als bei einer glatten Oberfläche.
Es kann aber auch vorkommen, dass Rezeptor und Ligand sich verbinden. Um diese Verbindung zu lösen, muss der Cantilever mit enormer Kraft von der Oberfläche weggerissen werden. Mit einem Ruck saust also der Cantilever nach oben, was wieder ein spezielles Bild am Computer ergibt. (graphisch beim Ziehen eine halbkreisförmige Verschiebung und dann im sog. "unbinding moment" eine gerade Linie nach oben)
Gestern hatte ich die Aufgabe, diese "unbinding moments" mit dem Programm MATLAB in jewweils 1000 gemessenen Bildern zu markieren.
Was ich bis jetzt so gecheckt habe, verwendet man das AFM zur Messung der Verschiebung und zur Messung der Kraft, die für den "unbinding moment" nötig ist. Dabei gilt das Hooksche Gesetz, das wir ja irgendwie schon mal gelernt haben ;) F=delta z * k
delta z ... Verschiebung
k.... Spring Constant (Federkonstante)
14.7.10 - Heute haben wir mit dem MAC-Cantilever gearbeitet. Der Unterschied zum normalen Cantilever ist dabei, dass der MAC-Cantilever statt Abtastbewegungen auf und ab gehende Klopfbewegungen macht. Diese Bewegungen entsprechen Schwingungen. Die beste Amplitude ergibt sich dabei aus der Eigenfrequenz des Cantilevers, die man gleich am Anfang am PC herausfinden will. Natürlich kann es auch sein, dass der Cantilever zu hart auf die Oberfläche aufklopft und dabei beschädigt wird. Deshalb ist es der nächste Schritt, den Cantilever schrittweise an die Oberfläche anzunähern. Der Moment, in dem er aufkommt, ist erkennbar durch eine ruckartige fallende Linie nach unten. Was wir im Versuch mit alex und Andi herausfinden wollten, war die durchschnittliche Anzahl an Proteinen in Lipiden und ihren Höhenabstand zu den Lipiden. Lipide sind Zellhäute, Fette. Sie bestehen aus Kopf- & Schwanz - Doppelpaaren, wobei der hygroskopische Kopf in Richtung der Zellflüssigkeit orientiert ist. Proteine sind in Lipide eingebaut und ragen an der Oberfläche heraus, also liegen höher als die Lipide.
Mit Andreas wollten wir mit dem MAC-Cantilever ein Loch aus einer Oberfläche "heraushacken", was irgendwie auch über Tiefe und Dichte eines Stoffes aussagt. Das Loch war am Bild schwach erkennbar, aber leider haben wir den Cantilever zerstört - die Peaks - sanfte Stocherungen - waren nicht sanft genug ;)
19.7.
Heute haben wir einen Cantilever mit dem AFM untersucht. Der Cantilever besteht aus Silicium-, Chrom- und Goldschichten (Gold zum Reflektieren der Cantileverbewegungen fürs Computerbild und Chrom als Beschichtung, damit Gold haftet). Durch das Zusammenwirken dieser Stoffe kann es zur Verbiegung des Cantilevers kommen.
Weiters habe ich noch Details über die verschiedenen Modi erfahren. Beim Mac-Mode und beim Tapping-Mode versucht das AFM die Amplitude des Cantilevers konstant zu halten. Beim Mac-Mode ist es also die Kunst, dass die Bindung von Rezeptor und Legand nicht abreißt, also sich der Cantilever nach der Störung wieder einpendelt. Der Unterschied zwischen Mac-Mode und Tapping-Mode ist, dass beim Mac-Mode die Bewegung des Cantilevers magnetisch angeregt wird und beim Tapping-Mode akkustisch. Beim Contact-Mode versucht das AFM die Verbiegung des Cantilevers konstant zu halten, beim Abtasten der Oberfläche kommt es also zur Topografie-Änderung am Computerimage oder zu einer kurzen Störung beim Abriss einer Bindung. Heute, zum Beispiel, die Bindung von Streptavitin und Biotin an der DNA.
Zum Schluss habe ich dann noch die Flüssigkeit zum Lipide Messen gereinigt. Die Lipide, die an der Oberfläche schwimmen, könnten an den Spitzen kleben bleiben. Daher haben wir sie mit einer Pipette abgesaugt und gleichzeitig mit einer anderen wieder Flüssigkeit nachgefüllt - darf nicht austrocknen.
20.7.10
Heute bin ich mit Babsi in einem gespenstisch langen weißen Kittel ins Chemie-Labor gejoggt und habe 100 mg einer Linker-Flüssigkeit abgefüllt. Der Linker (mPAG thiol, wobei thiol eine SH-Gruppe ist) wird an den Spitzen angebracht. Dabei haben wir 100 mg Linker-Flüssigkeit abgewogen, in ein Döschen gefüllt, mit Argon duch Beblasen den Sauerstoff verdrängt (Argon ist schwerer als Luft, sinkt zu Boden und verdrängt die Luft) und das Döschen mit Hilfe einer Krimp-Zange fest verschlossen. Anschließend beschriftet, in ein noch größeres Gefäß mit Silica-Gel gegeben (das blaue Silica-Gel saugt Flüssigkeit auf und verfärbt sich rosa - durch Erhitzen wird es wieder blau) und wieder verschlossen. :)
Dann habe ich mit Isa weiter die Bindung von Trombin und Aptamer ausgearbeitet. Dabei hat mir Andreas erklärt, dass es auch grundsätzliche Schwingungen gibt, alleine durch Tempertatur und die Geräuschkulisse - deshalb sind in unseren Bildern dauerhafte Schwingungen des Cantilevers. Eine andere Störung, die nicht mit einem tatsächlichen unbinding moment verwechselt werden darf, ist die Adhäsion. Schon auf natürliche Weise bleiben Spitze und Oberfläche manchmal aneinander kleben, binden sich aber nicht. Der Abriss davon sieht ähnlch aus wie ein unbinding moment, der Cantilever verbiegt sich dabei aber nicht langsam, sondern reißt gleich von der Oberfläche weg.
