Mkk7 ist ein Protein, das in jeder Zelle, und zwar im Cytoplasma, vorkommt. Es ist involviert in die Signaltransduktion, d.h. es ist an der Weitergabe eines Signals (meist von der Zellmembran in die Zelle und auch in den Kern) beteiligt.
Beispiel: Ein Wachstumshormon bindet an einen Rezeptor an der Membran, der dadurch aktiviert wird und das Signal in Form von Phospholierung zuerst ins Zellinnere und dann in den Kern weiterleitet. Im Kern werden dann Gene aktiviert, die zur Teilung (=Wachstum) beitragen.
Mkk7 dürfte im Cytoplasma bei solch einer Signaltransduktion eine Rolle spielen - und mein Betreuer beschäftigt sich nun damit, in wieweit dies wahr ist. Sehr interessant ist allerdings: Wenn man Zellen hat, die kein Mkk7 mehr enthalten, teilen sie sich DENNOCH häufiger (wie VERMUTLICH auch mein Zellenexperiment zeigt). -----> D.h. Mkk7 KÖNNTE ein Tumorsuppressor sein!

Irgendwie schon traurig. Sehr sogar - die drei Wochen am Institut für Molekulare Biotechnologie (ich muss es noch einmal ausschreiben, der Name hört sich so gut an ;-) sind viel zu schnell vergangen. Wahrscheinlich aber auch nur deshalb, weil mein Betreuer Daniel Schramek sich sehr nett und (sagen wir mal so) "aufopfernd" um mich gekümmert hat! Neben seiner sehr anstrengenden Arbeit, hat er sich nämlich auch noch die Mühe gemacht, mir alles ganz genau zu erklären. Denn mir genügt es nicht, nur etwas oberflächlich zu verstehen - nein, es musste immer alles ins kleinste Detail besprochen werden. Und wenn es sein musste auch fünf Mal. So möchte ich an dieser Stelle (ganz offiziell :-) nochmal Danke sagen:

Danke Daniel, dass ich die drei Wochen gemeinsam mit dir arbeiten und durch den "Forschungsalltag" gehen durfte. Und wie versprochen, werde ich dich an dieser Stelle zitieren:

"Bakterien und Zellen kennen keinen Samstag und keinen Sonntag, obwohl sie doch auch vom Herrn geschaffen wurden" --> Der Alltag eines Molekularbiologen ist wirklich hart! Nicht einmal am Wochenende hat man eine Ruh' :-)


Und noch ein abschließendes Wort zu meinem Experiment "Wachstum von Zellen mit und ohne Mkk7":

Das Ergebnis des zweiten Durchlaufs:
Beide Wachstumskurven steigen exponentiell an, wobei sich die Zellen B (=Knock out mouse, =ohne Mkk7) rascher teilen als die Zellen A (mit Mkk 7)
Eine "Analyse" (bzw. ein Versuch dafür:-) werde ich in meiner Forschungsdokumentation "veröffentlichen" :-)

Meinen Zellen geht es supigut – und das freut mich umso mehr :-) Endlich funktioniert das Experiment wirklich. Meine Knock-out Zellen haben heute (Donnerstag) bereits einen Wert von 15,6 *10 5 cells/plate erreicht!!!!!!! Vergleich zum ersten Durchgang des Experiments: Mein höchster Wert (selbe Zeitspanne!) war 20,5 * 105 cells/plate (aber nach 5 Tagen und nicht nach 4 :-).
Morgen, an meinem letzen Tag, werden wir das Ergebnis besprechen. Aber bereits jetzt fällt mir auf: Die Zellen OHNE Mkk7 wachsen schneller!!!!!!!!!!!! *freu*

Ansonsten war ich wieder sehr lange im Histologylab beschäftigt. Und Gott sei Dank durfte ich wieder an die Cryo-Schneidemaschine, weil mit Paraffin stehe ich auf Kriegsfuß :-) Daniel ist so nett und wird mir diese Arbeit abnehmen :-) Schön langsam werde ich ein richtiger „Schneideexperte“. Die Lungen, die ich heute geschnitten habe, sind besonders schön geworden. Ich bin richtig stolz auf meine vollbrachte Arbeit!

Besonders interessant fand ich heute auch die neue Maschine, die mir Danie zeigte. Sie trägt den spannenden Namen FACS (=“Fluorescence Activated Cell Sorting“). Und macht folgendes: Das Prinzip der FACS-Analyse beruht auf optischen Signalen der Zellewenn sie von einem Laserstrahl getroffen wird. Und zwar werden bei dieser Analyse Antigene in der Zelle (oder auf dessen Oberfläche) mit fluoreszenz - markierten Antikörpern nachgewiesen. Diese Maschine kann sozusagen Zellen „sortieren“ – Zellen mit und ohne Antikörper!

Den Rest des Tages ließ ich in der Gelelektrophoresestation ausklingen. Nachdem ich zwei Gele „befüllt“ hatte und sie auch das erste Mal selbstständig erfolgreich unter UV-Bestrahlung fotografiert, ging’s um halb sieben müde nach Hause.

Und morgen ist leider schon der letzte Tag. Mh, muss das sein? Die Arbeit im Labor gefällt mir einfach so gut, am liebsten würde ich gleich für immer dort bleiben. Aber vielleicht ist es auch nicht schlecht vorher molekulare Biologie zu studieren. Weil dann versteht man ziemlich sicher alles besser (und schneller :-).Auf alle Fälle weiß ich schon was ich nächsten Sommer mache: Wie abgemacht mich bei Daniel melden und hoffentlich wieder dort arbeiten :-)

Am Dienstag wurde zunächst wieder einmal fleißig Zellen gezählt – das war diesmal aber gar nicht so einfach. Aus welchem Grund auch immer bekam ich bei denselben Zellen immer ganz unterschiedliche Werte – vermutlich habe ich die Zählkammer nach dem Reinigen mit 70% EtOH nicht genug „ausdampfen“ lassen und so die meisten Zellen gleich beim Auftragen auf die cover slights abgetötet. Aber dieses Problem ließ sich ja Gott sei Dank leicht beseitigen :-)

Viel wichtiger ist allerdings, dass ich per Zufall bemerkte, dass ich bei meinem erstes Zellexperiment die Werte richtig gezählt aber völlig falsch weiterverarbeitet bzw. völlig falsch weitergerechnet habe. Nach dem Eintragen der neuen Werte im Excell, sieht das Ergebnis nun endlich vernünftig aus. Und wieder musste ich feststellen: KLEINE FEHLER können in der Wissenschaft VERHEERENDE FOLGEN haben bzw. eben ein ganzes Ergebnis verfälschen!!!!!!!!!


Danach startete Daniel einen neuen Versuch mit dem spannenden Namen „Kinase Essay“, mit dem Ziel aus Zellüberresten Mkk7 zu gewinnen.
Beginnen wir ganz von vorne:
Zunächst müssen die Zellen stimuliert werden (dies geschieht mit einem speziellen Medium). Dann werden sie auf Eis gelegt und die Zellen sozusagen in ihrem Wachstum „gestoppt“. Nun können die Zellen lysiert werden, d.h. (vereinfacht gesagt) „kaputt gemacht“ werden. Dies erfolgt mit einem Isoton, welches bewirkt, dass Wasser in die Zelle eindringt und sie so zerreißt. Alles was sich im Inneren der Zelle befindet wird so „zum Vorschein“ gebracht. (Ich umschreibe das erhaltene Produkt immer nett mit „Zellengatsch“ :-) Mit einem Zellschaber (der aussieht wie ein kleiner Scheibenwischer) werden die Zellüberreste in ein Falcon gebracht und 30 Minuten lang mit 1300 rpm (rotations per minute) zentrifugiert. Es bildet sich ein Pellet, das v.a. aus den unauflöslichen Teilen der Zelle besteht (= v.a. Zellmembran). Oben befindet sich nach der Zentrifugation das lösliche Protein. Aus diesem löslichen Protein möchte Daniel dann Mkk7 aufreinigen, was mit Hilfe von Antikörpern geschieht, die ja immer ein spezifisches Protein binden. Mkk7 ist eine Kinase – d.h. ein Enzym, das an ein anderes Enzym ein Phosphat anhängt und es somit aktiviert…...
Letztendlich möchte Daniel mit diesem Experiment untersuchen ob auch nur aufgereinigtes Mkk7 (d.h. NACH dem Tod der Zelle) überhaupt noch aktiv ist. Dies sieht man indem ob Mkk7 einen Bindungspartner „findet“ oder eben nicht……

Heute war ein typischer Montag (wie Daniel mir bestätigte ;-). Da alle Experimente vor dem Wochenende abgeschlossen und am Wochenende bei einigen gefeiert wurde, war heute alles etwas chaotisch und hin- und hergerissen.
Zuerst besprachen wir das Ergebnis meines Zellenexperiments „Wachstum von Zellen mit und ohne Mkk7“, das ich am Wochenende in einem Excelldiagramm festgehalten habe. Juhu – die beiden Kurven steigen auf alle Fälle exponentiell an. Auch Daniels Reaktion (Zitat: „Na, das gefällt mir aber!“ :-) lässt darauf schließen, dass (obwohl einige meiner Zellen infiziert waren und ich so das Experiment mit den Knock-out Zellen am letzen Tag nicht mehr abschließen konnte :-( alles so halbwegs korrekt verlaufen ist. Obwohl man ja im Vorhinein NIE weiß, wie das Ergebnis aussehen soll bzw. wird.

Dennoch: Dieses Experiment wird wiederholt. Ich bin schon sehr gespannt ob sich die Zellen diesmal anders verhalten werden……

Am Nachmittag erlernte eine neue Technik um in Paraffin gegossene Proben zu schneiden. Wie auch schon beim Schneiden der eingefrorenen Organe, erfolgt dies mit Hilfe eines Microtoms. Sorgfältig erklärte mir der Leiter des Histologielabors, wie man mit den Proben umgeht:
Zunächst wird von dem Paraffinblock eine 2µm „dicke“ „Scheibe“ abgeschnitten. Die hauchdünne Probe wird dann zunächst (mit Hilfe eines Haarpinsels) in kaltes Wasser gelegt und auf einen Slight aufgetragen. Dann ab damit ins warme Wasser, in dem sich das Paraffin streckt, sozusagen „faltenfrei“ wird und die Probe noch besser erkennbar wird.
So – da das bei meinem „Vorzeiger“ superleicht aussah, stürzte ich mich sofort in die Arbeit. Aber sehr bald stellte sich heraus, dass ich nicht gerade der geborene „Paraffinexperte“ bin. Sobald ich die Kurbel in Gang setzte, kamen immer nur Paraffin“rollen“ zum Vorschein – weit entfernt von einer hauchdünnen Probe!
Nach drei Stunden mühevoller Arbeit, war endlich ein Ende in Sicht. Ich hoffe auf alle Fälle, dass ich in meinen letzten Tagen am IMBA vor dieser Arbeit verschont bleibe. Aber so ist das halt im Leben – man kann nicht immer nur superspannende Sachen machen, denn dann würde man diese ja gar nicht mehr erkennen :-)

Heute (Donnerstag) war nicht sonderlich viel zu tun. Bis auf zwei Gele gießen und eine PCR auf Gel auftragen, ist heute nicht wirklich was passiert. Ich war heute eher mit Beobachten und viele Fragen stellen beschäftigt. So arbeitete Daniel z.B. heute mit Restriktionsenzymen, sogenannten molekularen Scheren, mit dessen Hilfe der Einbau von Fremd-DNA in einen Vektor (in unserem Fall: ein Plasmid) erst möglich wird. Und ich war sehr stolz auf mich, dass ich EcoRI (eines dieser Enzyme, das DNA bei einer bestimmten Basensequenz schneidet) noch aus dem Biologieunterricht kannte :-)

Und noch eine wichtige Erkenntnis, die sich beim Fragen stellen eigentlich zufällig gab: Glycerin ist gar nicht so böse wie im Chemieunterricht behauptet!!! Klar – in der Hautcreme ist es nicht von Vorteil! ABER für den Körper ist es lebensnotwendig – kein Glycerin, keine Zellmembran!

Ansonsten habe ich mich heute natürlich auch mit „meinen“ Zellen beschäftigt – sie wachsen, aber - irgendwie stimmt mit meinen Rechnungen nicht immer alles… und irgendwie habe ich das Gefühl, dass sich die Zellen ohne Mkk 7 anders verhalten sollten….aber wieso tun sie es nicht??

FAZIT: Fragen über Fragen – ein typisches Forscherleben ? ;-)