Day ONE and TWO:
An unserem ersten Tag am Institut für Biophysik durften wir mit DI Mario Brameshuber an seinem Projekt arbeiten. Mit Hilfe der Single-Dye-Tracing-Mikroscopy wollen wir uns näher mit den Bewegungsabläufen und Zuständen Der Zellmebran beschäftigen. Uns interessiert dabei besonders Zusammenschlüsse von mehreren Proteinen, sogenannte Flöße (engl. rafts). Solche Rafts bestehen meist aus Di-, Tri-, oder Tetrameren und diffundieren auf der Oberfläche der Biomebran von Zellen. Sie spielen unter anderem in der Immunologie eine wichtige Rolle. Mit unseren Messungen wollen wir beweisen, dass sich beim erstmaligen erhöhen der Temperatur (Fieber) diese Rafts trennen. Werden sie jedoch ein zweites Mla erhitzt so haben sie mit dem Fieber umgehen glenert und bleiben im Raftverband, soweit unsere Hypothese.
Um überhaupt einzelen Moleküle sichtbar zu machen benötigt es einer eigenen Technik, der sogenannten Single-Dye-Tracing-Microscopy. Dabei werden Proteine mit einem Fluoreszenzfarbstoff gentechnisch gelabbelt um sie bei der Untersuchung mit einem Laser anzuregen. Wir verwenden bei unserem Experiment einen H20-gekühlten Argon- und einen Kryptonlaser, die Kanäle für verschiedene Farben darstellen. Es wird der Laserstrahl durch verschiedene Spiegel und AOMs in die gewünschte Welenlänge aufgetrennt, die je nach Protein verschieden sein muss. Der Strahl trifft im Mikroskop dann auf die Probe und regt den Fluoreszenfarbstoff in der Mebran zum Leuchten an. Dabei springen einzelne Atome von grundzustand in ein höheres Energieniveu, beim zurückspringen wird Energie in Form von Photonen frei, also Licht. Dieses Leuchten wird von einer hochsensiblen Kamera aufgezeichnet, die konstant auf einer Temperatur von -110 Grad Celsius gehalten wird. Da in unserer Probe eine Unzahl von fluoreszenmarkeirten Proteinen existiert müssen wir es irgendwie Zustande bringen aus eineer Vielzahl von Signalen einzelen zu machen. Diese Methode wird toccsl genannt und ist die Abkürzung für: Thinning out clusters while conserving the stöchiometry of labeling. Das heißt es wird ein bestimmter Bereich der Zellmebran durch erhöhte Bestrahlung mit Laser ausgebleicht, an dem sofort wieder Teilchen durch Diffusion nachwandern. Diese nachwanderden Proteine sind mit einer sehr hohen Wahrscheinlcihkeit einzelen Proteine. Möglich wird die Fotografie der Zellen erst durch die TIRF EInstellung, das bedeutet Total INternal Reflection und passiert durch das Phänomen der evaneszenten Welle. Dieses Phänomen basiert auf der totelan Reflexion, es wird der Winkel des einfallenden Laserstrahls so steil gewählt, dass er zur Gänze wieder zurückreflektiert wird. Dabei wird nur die unterste Eben der Probe beleuchet und somit die Anregung aller Fluorofore in der Zelle verhindert, die unserer Ergbnisse ja erheblich verfälschen würde. Dabei müssen die Brechungsindices der veschiedenen Materialien berücksichtigt werden, und ein tropfen Öl mit dem INdex 1,518, also dem von der Linse, dem Objektträger anzugleichen. Anschließend wird mit verschiedenen Programmen die Intensität der Leuchtsignale gemessen und es kann somit Rückschluss über eventuelle Zusammenschlüsse (Rafts) von Proteinen gegebn werden.
Das Resultat unseres Experiments brachte leider unsere Theorie zum Fall. Wie schon vorher erwähnt wollten wir beweisen, dass beim erstmaligen Erhitzen sich alle Rafts zu einzelen Proteinen (Monomeren) trennen um bei zweiten Erhöhen der Temperatur zusammenzubleiben. Leider konnten wir nach der Analyse feststellen, dass nur 49% aller Signale Monomere darstellten, der Rest lag in Form von Di-, Tri-, und Tetrameren vor.

Day ONE and TWO:
An unserem ersten Tag am Institut für Biophysik durften wir mit DI Mario Brameshuber an seinem Projekt arbeiten. Mit Hilfe der Single-Dye-Tracing-Mikroscopy wollen wir uns näher mit den Bewegungsabläufen und Zuständen Der Zellmebran beschäftigen. Uns interessiert dabei besonders Zusammenschlüsse von mehreren Proteinen, sogenannte Flöße (engl. rafts). Solche Rafts bestehen meist aus Di-, Tri-, oder Tetrameren und diffundieren auf der Oberfläche der Biomebran von Zellen. Sie spielen unter anderem in der Immunologie eine wichtige Rolle. Mit unseren Messungen wollen wir beweisen, dass sich beim erstmaligen erhöhen der Temperatur (Fieber) diese Rafts trennen. Werden sie jedoch ein zweites Mla erhitzt so haben sie mit dem Fieber umgehen glenert und bleiben im Raftverband, soweit unsere Hypothese.
Um überhaupt einzelen Moleküle sichtbar zu machen benötigt es einer eigenen Technik, der sogenannten Single-Dye-Tracing-Microscopy. Dabei werden Proteine mit einem Fluoreszenzfarbstoff gentechnisch gelabbelt um sie bei der Untersuchung mit einem Laser anzuregen. Wir verwenden bei unserem Experiment einen H20-gekühlten Argon- und einen Kryptonlaser, die Kanäle für verschiedene Farben darstellen. Es wird der Laserstrahl durch verschiedene Spiegel und AOMs in die gewünschte Welenlänge aufgetrennt, die je nach Protein verschieden sein muss. Der Strahl trifft im Mikroskop dann auf die Probe und regt den Fluoreszenfarbstoff in der Mebran zum Leuchten an. Dabei springen einzelne Atome von grundzustand in ein höheres Energieniveu, beim zurückspringen wird Energie in Form von Photonen frei, also Licht. Dieses Leuchten wird von einer hochsensiblen Kamera aufgezeichnet, die konstant auf einer Temperatur von -110 Grad Celsius gehalten wird. Da in unserer Probe eine Unzahl von fluoreszenmarkeirten Proteinen existiert müssen wir es irgendwie Zustande bringen aus eineer Vielzahl von Signalen einzelen zu machen. Diese Methode wird toccsl genannt und ist die Abkürzung für: Thinning out clusters while conserving the stöchiometry of labeling. Das heißt es wird ein bestimmter Bereich der Zellmebran durch erhöhte Bestrahlung mit Laser ausgebleicht, an dem sofort wieder Teilchen durch Diffusion nachwandern. Diese nachwanderden Proteine sind mit einer sehr hohen Wahrscheinlcihkeit einzelen Proteine. Möglich wird die Fotografie der Zellen erst durch die TIRF EInstellung, das bedeutet Total INternal Reflection und passiert durch das Phänomen der evaneszenten Welle. Dieses Phänomen basiert auf der totelan Reflexion, es wird der Winkel des einfallenden Laserstrahls so steil gewählt, dass er zur Gänze wieder zurückreflektiert wird. Dabei wird nur die unterste Eben der Probe beleuchet und somit die Anregung aller Fluorofore in der Zelle verhindert, die unserer Ergbnisse ja erheblich verfälschen würde. Dabei müssen die Brechungsindices der veschiedenen Materialien berücksichtigt werden, und ein tropfen Öl mit dem INdex 1,518, also dem von der Linse, dem Objektträger anzugleichen. Anschließend wird mit verschiedenen Programmen die Intensität der Leuchtsignale gemessen und es kann somit Rückschluss über eventuelle Zusammenschlüsse (Rafts) von Proteinen gegebn werden.
Das Resultat unseres Experiments brachte leider unsere Theorie zum Fall. Wie schon vorher erwähnt wollten wir beweisen, dass beim erstmaligen Erhitzen sich alle Rafts zu einzelen Proteinen (Monomeren) trennen um bei zweiten Erhöhen der Temperatur zusammenzubleiben. Leider konnten wir nach der Analyse feststellen, dass nur 49% aller Signale Monomere darstellten, der Rest lag in Form von Di-, Tri-, und Tetrameren vor.

Halbzeit zweite Woche - die Zeit vergeht wie im Flug, schade eigentlich, denn die Arbeit ist immer abwechslungsreich und interessant und die Mitarbeiter beantworten alle Fragen geduldig, seien sie auch noch so blöd.
Schön langsam bekommen wir Praxis im Umgang mit den optischen Geräten und Apparaten und durften unter der Aufsicht von Lars sogar die zu untersuchenden Proben fokusiern und aufnehmen - spannend durch und durch. Leider konnten wir nicht viel sehen (nein, nicht weil wir uns so bld anstelten, sondern weil die meisten Zellen leider tot waren)

In der zweiten Woche durften wir Jarek und Jens-Peter bei der Arbeit über die Schulter schauen. Um unsere Messungen jedoch überhaupt durchführen zu können, besser gesagt um Proben zum Messen zu erzeugen unternahmen wir einen kurzen Trip zum UAR (Upper Austrian Research), dass ein spezielles Gerät (den Spotter) beherbergt, das uns das Erzeugen unserer Proben erst möglich machte.
Zurück im INstitut ging es dann wieder an die Messarbeit.

Der fünfte und letzte Tag der Woche war eine Labor-Session mit Verena, bei der wir wie schon zu Beginn der Woche Messungen mit dem Laser-Setup machen durften.
Während wir Messungen vornahmen, Verena über Uni & Co. ausquetschten (die natürlich charmant allle unsere lästigen Fragen überaus detailiert beantwortete), entbrannte gleichzeit eine heiße politsche Diskussion über Natascha Kampusch und Konsorten, die die Gemüter von uns Praktikanten zum Kochen brachte.
Aber glücklicherweise schaffte es Verena uns wieder im Geiste der Einzel-Molekül-Mikroskopie zu vereinen.

Schön langsam spielt sich die Routine im Umgang mit den verschiedenen Abläufen sowohl außerhalb als auch innerhalb des Instituts ein. Die lange Anreisezeit zur Uni (immerhin 1 1/2 Stunden) und der (gefühlt) noch längere Weg im Lift haben sich mittlerweile verkürzt und sind sogar dank vieler netter und kommunikativer Leute ganz lustig geworden.
Die zweite Hälfte verbrachten wir mit Michi, die sozusagen eine Art Bindeglied zwischen den Physikern und Biologen darstellt.
Bei Michi wurden nicht nur die biologischen Präparate (der erste Umgang mit Pipetten und Co.), sondern auch unsere Hirnzellen (chemsiches Rechnen gehört noch nicht zu unseren Stärken) ganz schön gefordert.
Mit den Details zu den einzelnen Experimenten und Versuchsabläufen will ich an dieser Stelle meinne Leser (falls die überhaupt existieren) nicht stören. Ich verweise einfach auf meine Forschungsdokumentation (noch im Aufbau).