1.Tag
Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird zuerst die DNA (Orai3) verkürzt durch Primer. Es gibt einen forward Primer (markiert den neuen Beginn) und den reverse Primer (am Ende des Stranges).
Für die PCR benötigt man neben der DNA (-Template) und dem fw und rev Primer noch den Pfu-Puffer, die dNTPs, Wasser und abschließend die Pfu Polymerase. In passendem Verhältnis zusammengeführt, werden die Reaktionsgefäße in einen Heizblock (Thermocycler) gegeben.
Im ersten Schritt wurde eine Minute auf 95° erhitzt um die DNA-Stränge zu trennen. Diesen Vorgang nennt man Denaturierung.
Im zweiten Schritt wurde für 30 Sekunden wieder auf 95° erhitzt um eine weitere Denaturierung zu ermöglichen. Das Annealing (Anlagerung der Primer) erfolgt weitere 45 Sekunden bei 62°. Danach wird die DNA Polymerase angelagert (Extention) indem man eine Minute auf 72° erhitzt. Der zweite Schritt wird 29 mal wiederholt..
Im dritten Schritt wird die Extention nochmals ermöglicht indem für 3 Minuten auf 72° erhitzt wird.
Die Werte können variieren.

2.Tag:
Analysierung mittels zwei prozentigem Agarosegel:
Auf eine Gelplatte wird ein Marker (Bench Top Marker) zugeführt und die verschiedenen Ansätze. Dies "läuft" nun unter angelegter Spannung in der Platte. Der Marker markiert die Anzahl der Basenpaare (bp).
Beispiel: Der Ansatz delta 1-57 Orai3 hatte zu Beginn 295 Aminosäuren, durch den Primer fehlen nun aber 57AS also ergeben sich nun 238AS. Drei Basen codieren eine Aminosäure. Somit ergeben sich 714bp.
Bei der heutigen Analysierung trafen die gerechneten Werte auf die analysierten zu.
Elution:
Nach der Analysierung wird die DNA Bande ausgeschnitten und in ein Eppi gegeben. Pro Eppi wird 700mikroL Membrane Binding Solution hinzugeführt.
Der Ansatz wird geschmolzen, das gelöste Gel in Minisäulen pipetiert, 1min inkubiert und 1min bei 14000rpm zentrifugiert. Danach fügt man 700mikroL Membrane Wash Solution auf die Minisäule, zentrifugiert und fügt weitere 500mikroL hinzu und zentrifugiert wieder.
15mikroL Wasser werden auf die Minisäule pipetiert, nach dem Inkubieren und Zentrifugieren wird die nun gelöste DNA bei 4° oder -20° gelagert.
Polyadenylierung:
eluierte DNA + dATP + Tag Polymerase + Tag Puffer
dann inkubieren bei 72° (15min) und auf Eis geben
Topo Cloning:
DNA von vorhin + Salt Solution + Topo Vektor
5min inkubieren. Ergebnis: das PCR Produkt ist im Vektor eingebaut.
Transformation (Vektor wird in Bakterien eingebacht):
Bakterien = Top Ten Colis
DNA von vorhin zu den Colis und auf Eis.
Der Hitzeschock (30s bei 42°) macht die Membran der Bakterien porös und der Vektor kann aufgenommen werden.
SOC-Medium wird jedem Eppi hinzugefügt und eine Stunde geschüttelt. Anschließend bringt man die Bakterien auf Ampicillinplatten (sollten Ampicillinresistanz besitzen) und dort wachsen sie über Nacht im Brutschrank bei 37°.