heute stand unter anderem am plan, das lysat für den western blot am montag herzustellen. zu beginn haben wir die zellen mit dem Casy (ein gerät) gemessen. dazu resuspendierte ich vorerst die zellen, entnahm 50ul davon und pipettierte sie in ein so genanntes Casy-Röhrchen. zum messen kamen noch 5 ml pro röhrchen von einem puffer dazu.
anschließend pipettierte ich eine bestimmte anzahl an zellen in ein falcon und zentrifugierte es für 3min. danach saugte ich den überstand weg und erhielt mehrere pellets gleicher größe. daraufhin resuspendierte ich die zellen in 50ul FCS-medium und pipettierte es dann in EPPIs. diese kamen dann für 1h in den inkubator.
in der zwischenzeit stellten wir den zweiten assay fertig.
nach der einen stunde kamen die eppis auf eis und ich habe ausgerechnet wieviel antikörper wir zur stimulation brauchen. nun kam stimulationsmedium in die eppis und sie wurden dann für unterschiedliche zeitspannen (0,1,5 und 30min) auf 37°C gestellt. nach der jeweiligen zeit kam noch kalter puffer in die eppis und um die stimulation zu stoppen wurden sie wieder auf eis gestellt.
danach wurde noch abgefugt, der überstand entfernt, in Lämmli-Puffer resuspendiert und in flüssigem stickstoff schockgefroren. zur sicherheit trugen wir stylische schutzbrillen als wir mit dem rauchenden stickstoff arbeiteten.
anschließend splittete ich meine zellen noch über das wochenende.

am 9. tag meines praktikums haben wir denselben assay vom tag 7 noch einmal angesetzt. denn umso öfter man den versuch durchführt, desto besser kann man die ergebnisse überprüfen oder vergleichen. der einzige unterschied ist, dass nun die zellen 2 tage älter sind.
anschließend durfte ich meine adhärenten zellen (also meine HEK-zellen) splitten. dazu saugte ich zuerst das medium ab und pipettierte 1ml Trypsin dazu. das bewirkt, dass sich die zellen von dem Flaschenboden lösen. danach werden 9ml neues medium dazugegeben, was die wirkung von trypsin stilllegt. das ganze gemisch wird dann in einem falcon zentrifugiert und danach wird der überstand wieder abgesaugt und das pellet bleibt über. 18ml medium kommen nun wieder in die ursprüngliche flasche. davon entnimmt man 1ml und resuspendiert damit das pellet. je nach dem wie stark man die zellen splitten will, entnimmt man nur einen teil von den resuspendierten zellen und pipettiert sie zurück in die flasche. pro tag kann man rechnen die zellen 1:2 zu splitten.
danach war es an der zeit die proteinkonzentration vom lysat vom ersten assay zu messen. ein lysat ist eine zelle, aufgelöst in ihre bestandteile, in eimem lysisbuffer. die messung geschieht nach der Bradford-methode, das heißt ich habe etwas bradford-reagenz zu den lysaten gegeben und die flüssigkeit verfärbt sich durch die proteine von braun zu blau. je nach dem wie blau die flüssigkeit ist, kann ein gerät die proteinkonzentration messen. dieses gerät wird ELISA-reader genannt.
die daten analysierte ich anschließend mit excel und erstellte auch diagramme :D
damit war der tag auch zu ende.