es war wieder einmal mittwoch, also meeting um 9 uhr. und dieses mal kam ich sogar pünktlich. XD
anschließend starteten wir endlich mit der PCR, die wir zum mutanten herstellen anwenden.
eine PCR (=Polymerase Chain Reaction) ist eine methode, die DNA zu vervielfältigen.
zuerst die zutaten:
-taq-Polymerase (kopiert DNA-Abschnitt)
-10x Puffer
-dNTP (basenbausteine für den synthetisierten DNA-Strang)
-2 Primer (um den zu kopierenden abschnitt zu begrenzen)
-DNA
-Wasser
-MgCl2 (für die funktion der polymerase essentiell)

rezept:
zuerst mischte ich einen mastermix aus puffer, dNTP, H2O und MgCl2. verena mischte in der zwischenzeit DNA und den entsprechenden primer. anschließend wird der mastermix zu der DNA mit den primern dazupipettiert. danach kam die taq-polymerase dazu und am ende kamen die eppis über nacht in eine PCR-Maschine.

zu beginn des tages wurden die membranen vom western blot mit einem TBST-Puffer gewaschen. diesen puffer habe ich vorher sogar selbst hergestellt XD. das waschen ist dazu da, die losen antikörper wegzuwaschen, denn am ende will man nur die auswerten, die wirklich gut haften.
danach kam der sekundärantikörper auf die membranen und wurde 1h lang inkubiert. der sekundärantikörper bindet sich nun aber nicht mehr an die proteine, sondern an die primärantikörper, die auf den proteinen sitzen. nach der einen stunde wurden die losen antikörper wieder weggewaschen.
da man später die membranen mit einem Fuji (ein Gerät) "fotografieren" will, verteilte ich ein substrat auf die membranen. ein enzym vom sekundärantikörper spaltet das substrat, wodurch licht frei wird und so kann man dann ein "Foto schießen".
später analysierte ich noch die daten der zweiten assay mit excel und meine zellen splittete ich auch noch.

Western Blot bezeichnet die übertragung von proteinen auf eine trägermembran.
am anfang goss ich ein gel in eine form aus glasplatten. dieses gel hat kleine taschen, auch slots genannt, in die wir dann später, also nachdem das gel auspolymerisiert war, die lysate vom freitag luden. das ganze wurde dann unter strom gestellt (100-130V) und wegen der elektrophorese wanderten die proteine durch das gel nach unten zum pluspol.
nach zirka 1,5h waren die proteine im gel nach deren größe aufgetrennt. anschließend machte ich einen Semi-Wet Blot. dabei bringt man die proteine auf eine spezielle membran, indem man eine art "sandwich" macht.
zuerst legte ich die membran auf ein filterpapier, das mit puffer angesoffen war. danach holte ich das gel vorsichtig aus den glasplatten und legte es auf die membran. die oberste schicht war wieder ein nasses filterpapier. zum schluss rollte ich noch die luftblasen aus dem "sandwich", das dann noch geladen, also 1h lang geblottet wurde.
danach stellte ich noch eine 5%ige milch her. die ist dazu da, den platz auf der membran an denen keine proteine sitzen mit milchproteinen zu blockieren, da später noch antikörper auf die membran kommen und die sich nicht auf die falsche stelle platzieren sollen
ingesamt kommen zwei antikörper gegen phosphatgruppen von signalmolekülen auf die membran. die membranen haben wir zerschnitten, da sich jeder antikörper nur an proteine bestimmter größe bindet. danach kam die membran in ein falcon in das wir vorher eine 2,5%ige milch und den spezifischen primärantikörper pipettiert haben. wir ließen dann die falcons über nacht bei 4°C rotieren.