Magdalena's Blog

TAG 13: PCR I

2009-08-27T23:16:44Z

es war wieder einmal mittwoch, also meeting um 9 uhr. und dieses mal kam ich sogar pünktlich. XD
anschließend starteten wir endlich mit der PCR, die wir zum mutanten herstellen anwenden.
eine PCR (=Polymerase Chain Reaction) ist eine methode, die DNA zu vervielfältigen.
zuerst die zutaten:
-taq-Polymerase (kopiert DNA-Abschnitt)
-10x Puffer
-dNTP (basenbausteine für den synthetisierten DNA-Strang)
-2 Primer (um den zu kopierenden abschnitt zu begrenzen)
-DNA
-Wasser
-MgCl2 (für die funktion der polymerase essentiell)

rezept:
zuerst mischte ich einen mastermix aus puffer, dNTP, H2O und MgCl2. verena mischte in der zwischenzeit DNA und den entsprechenden primer. anschließend wird der mastermix zu der DNA mit den primern dazupipettiert. danach kam die taq-polymerase dazu und am ende kamen die eppis über nacht in eine PCR-Maschine.

TAG 12: Western Blot II

2009-08-27T23:03:34Z

zu beginn des tages wurden die membranen vom western blot mit einem TBST-Puffer gewaschen. diesen puffer habe ich vorher sogar selbst hergestellt XD. das waschen ist dazu da, die losen antikörper wegzuwaschen, denn am ende will man nur die auswerten, die wirklich gut haften.
danach kam der sekundärantikörper auf die membranen und wurde 1h lang inkubiert. der sekundärantikörper bindet sich nun aber nicht mehr an die proteine, sondern an die primärantikörper, die auf den proteinen sitzen. nach der einen stunde wurden die losen antikörper wieder weggewaschen.
da man später die membranen mit einem Fuji (ein Gerät) "fotografieren" will, verteilte ich ein substrat auf die membranen. ein enzym vom sekundärantikörper spaltet das substrat, wodurch licht frei wird und so kann man dann ein "Foto schießen".
später analysierte ich noch die daten der zweiten assay mit excel und meine zellen splittete ich auch noch.

TAG 11: Western Blot I

2009-08-27T22:40:19Z

Western Blot bezeichnet die übertragung von proteinen auf eine trägermembran.
am anfang goss ich ein gel in eine form aus glasplatten. dieses gel hat kleine taschen, auch slots genannt, in die wir dann später, also nachdem das gel auspolymerisiert war, die lysate vom freitag luden. das ganze wurde dann unter strom gestellt (100-130V) und wegen der elektrophorese wanderten die proteine durch das gel nach unten zum pluspol.
nach zirka 1,5h waren die proteine im gel nach deren größe aufgetrennt. anschließend machte ich einen Semi-Wet Blot. dabei bringt man die proteine auf eine spezielle membran, indem man eine art "sandwich" macht.
zuerst legte ich die membran auf ein filterpapier, das mit puffer angesoffen war. danach holte ich das gel vorsichtig aus den glasplatten und legte es auf die membran. die oberste schicht war wieder ein nasses filterpapier. zum schluss rollte ich noch die luftblasen aus dem "sandwich", das dann noch geladen, also 1h lang geblottet wurde.
danach stellte ich noch eine 5%ige milch her. die ist dazu da, den platz auf der membran an denen keine proteine sitzen mit milchproteinen zu blockieren, da später noch antikörper auf die membran kommen und die sich nicht auf die falsche stelle platzieren sollen
ingesamt kommen zwei antikörper gegen phosphatgruppen von signalmolekülen auf die membran. die membranen haben wir zerschnitten, da sich jeder antikörper nur an proteine bestimmter größe bindet. danach kam die membran in ein falcon in das wir vorher eine 2,5%ige milch und den spezifischen primärantikörper pipettiert haben. wir ließen dann die falcons über nacht bei 4°C rotieren.

TAG 10: eiskalter stickstoff XD

2009-08-27T21:15:49Z

heute stand unter anderem am plan, das lysat für den western blot am montag herzustellen. zu beginn haben wir die zellen mit dem Casy (ein gerät) gemessen. dazu resuspendierte ich vorerst die zellen, entnahm 50ul davon und pipettierte sie in ein so genanntes Casy-Röhrchen. zum messen kamen noch 5 ml pro röhrchen von einem puffer dazu.
anschließend pipettierte ich eine bestimmte anzahl an zellen in ein falcon und zentrifugierte es für 3min. danach saugte ich den überstand weg und erhielt mehrere pellets gleicher größe. daraufhin resuspendierte ich die zellen in 50ul FCS-medium und pipettierte es dann in EPPIs. diese kamen dann für 1h in den inkubator.
in der zwischenzeit stellten wir den zweiten assay fertig.
nach der einen stunde kamen die eppis auf eis und ich habe ausgerechnet wieviel antikörper wir zur stimulation brauchen. nun kam stimulationsmedium in die eppis und sie wurden dann für unterschiedliche zeitspannen (0,1,5 und 30min) auf 37°C gestellt. nach der jeweiligen zeit kam noch kalter puffer in die eppis und um die stimulation zu stoppen wurden sie wieder auf eis gestellt.
danach wurde noch abgefugt, der überstand entfernt, in Lämmli-Puffer resuspendiert und in flüssigem stickstoff schockgefroren. zur sicherheit trugen wir stylische schutzbrillen als wir mit dem rauchenden stickstoff arbeiteten.
anschließend splittete ich meine zellen noch über das wochenende.

TAG 9: und noch einmal von vorne :D

2009-08-27T20:58:45Z

am 9. tag meines praktikums haben wir denselben assay vom tag 7 noch einmal angesetzt. denn umso öfter man den versuch durchführt, desto besser kann man die ergebnisse überprüfen oder vergleichen. der einzige unterschied ist, dass nun die zellen 2 tage älter sind.
anschließend durfte ich meine adhärenten zellen (also meine HEK-zellen) splitten. dazu saugte ich zuerst das medium ab und pipettierte 1ml Trypsin dazu. das bewirkt, dass sich die zellen von dem Flaschenboden lösen. danach werden 9ml neues medium dazugegeben, was die wirkung von trypsin stilllegt. das ganze gemisch wird dann in einem falcon zentrifugiert und danach wird der überstand wieder abgesaugt und das pellet bleibt über. 18ml medium kommen nun wieder in die ursprüngliche flasche. davon entnimmt man 1ml und resuspendiert damit das pellet. je nach dem wie stark man die zellen splitten will, entnimmt man nur einen teil von den resuspendierten zellen und pipettiert sie zurück in die flasche. pro tag kann man rechnen die zellen 1:2 zu splitten.
danach war es an der zeit die proteinkonzentration vom lysat vom ersten assay zu messen. ein lysat ist eine zelle, aufgelöst in ihre bestandteile, in eimem lysisbuffer. die messung geschieht nach der Bradford-methode, das heißt ich habe etwas bradford-reagenz zu den lysaten gegeben und die flüssigkeit verfärbt sich durch die proteine von braun zu blau. je nach dem wie blau die flüssigkeit ist, kann ein gerät die proteinkonzentration messen. dieses gerät wird ELISA-reader genannt.
die daten analysierte ich anschließend mit excel und erstellte auch diagramme :D
damit war der tag auch zu ende.

TAG 8: Halbzeit

2009-08-20T09:28:50Z

wie jeden mittwoch war natürlich um PUNKT 9 uhr meeting und wer kam zu spät? ich natürlich... typisch
anschließend bekamen wir vom chef eine einschulung in ein fluoreszenz- und phasenmikroskop und das gerät ist echt cool. :)
danach haben wir mit dem nanodrop die DNA-Konzentration von "meiner" maxiprep gemessen und die werte waren sogar richtig gut. obwohl ich es gemacht habe XD
dann gab es leckeres indisches essen...mhhh
später war es soweit... ich durfte zum ersten mal meine jurkat-zellen splitten :)
an meinem halbzeitstag (leider jetzt schon) durfte ich etwas früher gehen und genoss die freizeit. :)

TAG 7: first assay

2009-08-19T08:37:40Z

am tag 7 haben wir den ersten versuch (assay) mit unseren silenced cells (CD147) angesetzt und ich war überrascht wie lange so etwas dauert. man muss mehrere stunden oder sogar 1 tag warten.
weiters machte ich alleine eine MaxiPrep (dasselbe wie miniprep, nur größer), aber natürlich unter der aufsicht von verena.
schaut wenig aus, aber in wahrheit haben wir viel erledigt.

TAG 6: Magdi bekommt babies XD

2009-08-18T07:50:18Z

am 6. arbeitstag meines praktikums überprüften wir die plasmide mit restriktionsverdau.
anschließend überprüften wir noch ob die zellen gesilenced sind, indem wir gefärbte antikörper dazugaben. durch die stärke der farbe kann man erkennen ob sie gesilenced sind oder nicht.
danach kam es zum höhepunkt des tages: ich bekam meine eigenen zellen um die ich mich nun alleine kümmern und meine mütterlichen fähigkeiten beweisen darf. XD
da wir am nächsten tag eine MaxiPrep machen werden setzten wir auch noch eine übernachtkultur von bakterien an.
dann war der tag auch schon wieder vorbei und ich hatte einen guten start in die woche.

TAG 5: 55 kleine eppis

2009-08-17T08:33:52Z

wieder einmal begann der tag mit lesen und auch ein bisschen rechnen.
anschließend haben wir 55 eppis für den restriktionsverdau beschriftet. um diese vielzahl an eppis zu füllen haben wir natürlich dem entsprechend viel pipetiert und ich bin jetzt schon richtiger profi darin :D. nun mussten wir 1 stunde warten, denn der verdau braucht auch seine zeit. in der zwischenzeit verdaute ich eine leckere pizza. :)
danach war es zeit unsere proben auf ein agarosegel zu laden. das agarosegel habe ich selber hergestellt indem ich einige substanzen zusammenmixte. beim laden durfte ich auch mithelfen und habe mich ganz gut geschlagen.
dann gings endlich ab ins wochenende!!!! :D

TAG 4: Kaiserschmarrn mit Zwetschgenröster XD

2009-08-14T08:15:56Z

zu beginn haben wir überprüft ob die gepickten bakterienkollonien angewachsen und es hat sogar funktioniert, obwohl ich auch welche gemacht habe :).
anschließend wurde jede menge pipetiert, denn wir machten DIRTY Mini-Preps. das heißt wir haben die bakterien getötet (muhahaha) und die plasmide rausisoliert.
um die mittagszeit herum gabs richtig leckeres österreichisches essen: Kaiserschmarrn mit Zwetschgenröster..... mhhhhh
danach messten wir die konzentration der mini-preps mit hilfe eines gerätes, dass nanodrop genannt wird.
später wurde dann noch etwas vorarbeit geleistet.

TAG 3: Rennen!!!

2009-08-14T08:13:04Z

am tag 3 war es wichtig um punkt 9 uhr aufzukreuzen, denn jeden mittwoch haben wir ein meeting, bei dem immer zwei leute eine so genannte paper presentation halten (auf englisch natürlich) und frühstück gibts auch noch :). die pünktlichkeit ist wie gesagt sehr wichtig, denn jede minute, die man zu spät kommt, muss man 10c in eine gemeinschafts-sparbüchse zahlen. zum glück hab ich es gerade noch rechzeitig geschafft, denn die straßenbahn ist mir vor der nase weggefahren. somit mussten meine füße herhalten und rennen :).
nach dem meeting musste ich eine zeit lang warten, denn wir bekamen ein neues gerät im stockwerk. ich vertrieb mir die zeit mit lesen und erfuhr immer mehr und mehr.
danach gab es mittagessen unter freiem himmel.
mit vollem magen haben wir die bakterien mit dem resistenzgen vom tag 2 kontrolliert und alles war in ordnung. anschließend haben wir 3 bakterien pro petri-schale mit einem staberl in ein LB-Medium gepickt und ich hab mich dabei gar nicht so blöd angestellt. über nacht wurden sie wieder bei 37°C geschüttelt.
danach durfte ich dann zuschauen, wie verena adhärente bindegewebszellen gesplittet hat. adhärent bedeutet, dass sie sich mit molekülen am boden festgrallen. zuerst wurde das alte medium abgesaugt und dann trypsin zu den zellen gelehrt. dieses trypsin hat die funktion, dass sich die zellen vom boden lösen. anschließend kam ein neues medium, das die trypsin-wirkung inaktivieren soll, ins fläschchen. aber wie gesagt durfte ich leider nur zuschauen um zu lernen. :)
und damit war der tag auch schon vorbei.

TAG 2: Endlich darf ich auch was tun! :)

2009-08-13T17:42:33Z

da die übernachtkultur vom tag davor nicht so toll funktioniert hat, haben wir am zweiten tag noch einmal 150ul von den bakterienstocks reingegeben. ich durfte mir auch den fridge in dem die stocks auf -80°C gelagert sind ansehen und das war echt cool. als wir die tür öffneten kam eine tolle weiße rauchwolke heraus und ich kam mir vor als wär ich ein eisbär. leider konnte ich kein foto schießen, da es im keller zu dunkel war aber es hat richtig professionell ausgesehen.
anschließend wurde wieder gelesen und ich wurde von minute zu minute klüger. :)
da die konfluenz von den HEK cells stimmte begannen wir mit der CaPO4-Transfektion. meine aufgabe dabei war, die menge der DNA zu berechnen. trotz einfacher schlussrechnung bekam ich erstmals einen schweißausbruch und im innern schrie ich "MAZ?!?!?!". ohja, mathematik ist hier auchgefragt, aber keine wirklich schwierigen rechnungen. die bekomme sogar ich auf die reihe.
aus salzen und DNA formen sich kristalle, so genannte präzipitate, die von den HEK cells aufgenommen werden und dadurch gelangen die plasmide in die producer cells. sobald die DNA dann drinnen ist, fängt die producer cell damit an den virus zu produzieren. ich durfte die präzipitate auch mikroskopieren, doch ich entdeckte leider keine diamanten... nur kleine schwarze punkte.
am nachmittag erhielten die zwei diplomanten in unserer abteilung und ich eine sehr sehr sehr ausführliche sicherheitseinführung. wir wurden aufgeklärt was wann wie und wo gemacht werden muss und wir erfuhren wo sich erste hilfe kästen, feuerlöscher und notfallduschen befinden.
anschließend haben wir kompetente bakterien (d.h. sie wurden aufnahmefähiger für plasmide gemacht) mit vier verschiedenen plasmiden transformiert und sie dann auf Petri-Schalen (in denen war schon Agar) mit hilfe eines Trigalsky-Spartels ausplatiert. in dem agar ist ampicillin (antibiotika) enthalten, gegen das die plasmide ein resistenzgen besitzen. somit können in den schalen nur die bacs wachsen, die sich mit dem plasmid verbinden, da sie dadurch das resistenzgen selbst produzieren. die restlichen bakterien sterben jedoch ab, da das ampicillin für sie gift ist. (diese tatsache, dass die bacs sterben wird selektion gennant) die schalen wurden dann über nacht bei 37°C warm gestellt.
um ehrlich zu sein hab ich das mit dem platieren schon ganz alleine gemacht, aber natürlich unter der aufsicht von verena. (applaus bitte!) das ausplatieren passierte in der nähe vom bunsenbrenner, denn in einem gewissen radius um das feuer ist die umgebung steril.
was ich an diesem tag noch machte war, dass ich einen buffer (=Puffer) mischte und vorher die menge der zutaten berechnete. jetzt war nicht nur mehr mathematik gefragt sondern auch chemie. MOLMASSE BERECHNEN!!!!!!!!! doch nach leichten startschwierigkeiten gelang es mir auch die rechnung zu lösen.
dieser buffer wird später für die transformation verwendet. was mich erstaunte war, was so alles auf den flaschen für die mischung von einem buffer obensteht: giftig, nicht in kontakt mit augen oder haut bringen.....aber zum glück wurde ich darauf hingewiesen die etiketten von den flaschen gründlich durchzulesen. wer weiß was ich sonst alles angestellt hätte ;)
heute wurde viel erledigt und ich denke, dass ich stolz auf mich sein kann.

TAG 1: Zuerst Theorie, dann Praxis!

2009-08-13T15:38:27Z

an meinem ersten tag kam ich um gut 9 uhr im labor an und wurde von den kollegen nett empfangen.
ich erfuhr gleich einmal, dass man sich am anfang gut einlesen muss und das tat ich auch. der computer berichtete mir über RNAi, plasmide, transfektion, translation, transduktion und ich bemerkte, dass ich doch noch was aus dem biologieunterricht mitgenommen habe, obwohl das kapitel cytologie schon 3 jahre her ist. außerdem war englisch gefragt! mit manchen kollegen kann man nur englisch reden und die meisten unterlagen sind auch englisch. ehrlich gesagt gefällt mir das sehr gut, denn im naturwissenschaftlichen bereich wollte ich meinen englischwortschatz schon immer ausbauen.
zu mittag gab es für mich eine leckere gemüselasagne (extra ohne fleisch :P ) !
am nachmittag wurde dann auch richtig im labor und in der gewebekultur gearbeitet, aber natürlich hab ich vorerst nur zugeschaut, nur,... bei was eigentlich?! ich verstand am ersten tag großteils nur bahnhof, doch es wurde von zeit zu zeit besser.
am anfang hat verena die zellen, die den virus für die spätere arbeit produzieren (producer cells), ausplatiert, sodass man bei einer 80% konfluenz am nächsten tag die CaPO4-Transfektion durchführen kann. die zellen die verwendet werden heißen HEK 293 cells und "HEK" steht für "Human Embryonic Kidney (cells)".
da wir von chlonierten mutanten die DNA vermehren und mit hilfe vom restriktionsverdau die richtigkeit unserer mutanten überprüfen wollen, haben wir übernachtkulturen aus bakterienstocks gezüchtet. unter einem stock (=back up) versteht man in glycerol eingelagerte bakterien, die man auf -80°C lagert und aus denen man immer wieder eine Nadelspize entnimmt und daraus tonnenweise bacs gewinnt, denn die bakterien verdoppeln sich alle 20 minuten!
so, das schaut jetzt ziemlich viel aus, doch am ersten tag war schon um 3 uhr schluss und ich durfte mit einem breitem grinsen im gesicht nach hause gehen. :)

Erster Eindruck

2009-08-11T08:59:37Z

so, mein erster arbeitstag ist vorbei und der erste eindruck ist toll :D meine kollegen sind auch supernett und freundlich. alles in allem gibts derweilen nichts zu meckern und ich hoffe das bleibt auch so.
zum glück ist im labor alles glatt gelaufen und ich habe nichts zerstört oder zertrümmert. die bakterien wachsen und die zellen sind gut versorgt und werden regelmäßig gefüttert.

Probleme / Aufgaben

2009-06-26T08:18:00Z

im grunde arbeiten meine superliebe betreuerin verena und ich mit CD147. natürlich wusste ich am anfang nada darüber, doch verena konnte es mir gut erklären und sie ist zum glück geduldig, denn am anfang hatte ich noch nicht wirklich den durchblick.
CD147 ("CD" steht für "Cluster of Differenciation") ist ein protein in der zellmembran.
wir untersuchen CD147 in T-zellen indem wir RNAi anwenden, d.h. wir "silencen" CD147 in der Zelle durch die shRNA-Technik ("sh" steht für "Short Hairpin"). anschließend untersuchen wir welche Funktionen die T-zelle dadurch verliert.
das ganze hört sich jetzt an, als würde das langweilig und an einem tag abgeschlossen sein, doch so einfach geht es nicht! es ist jede menge vorarbeit zu leisten und es gibt noch nicht für alles maschinen. und langweilig ist es überhaupt nicht! mir machts richtig viel spaß! :)