heute stand unter anderem am plan, das lysat für den western blot am montag herzustellen. zu beginn haben wir die zellen mit dem Casy (ein gerät) gemessen. dazu resuspendierte ich vorerst die zellen, entnahm 50ul davon und pipettierte sie in ein so genanntes Casy-Röhrchen. zum messen kamen noch 5 ml pro röhrchen von einem puffer dazu.
anschließend pipettierte ich eine bestimmte anzahl an zellen in ein falcon und zentrifugierte es für 3min. danach saugte ich den überstand weg und erhielt mehrere pellets gleicher größe. daraufhin resuspendierte ich die zellen in 50ul FCS-medium und pipettierte es dann in EPPIs. diese kamen dann für 1h in den inkubator.
in der zwischenzeit stellten wir den zweiten assay fertig.
nach der einen stunde kamen die eppis auf eis und ich habe ausgerechnet wieviel antikörper wir zur stimulation brauchen. nun kam stimulationsmedium in die eppis und sie wurden dann für unterschiedliche zeitspannen (0,1,5 und 30min) auf 37°C gestellt. nach der jeweiligen zeit kam noch kalter puffer in die eppis und um die stimulation zu stoppen wurden sie wieder auf eis gestellt.
danach wurde noch abgefugt, der überstand entfernt, in Lämmli-Puffer resuspendiert und in flüssigem stickstoff schockgefroren. zur sicherheit trugen wir stylische schutzbrillen als wir mit dem rauchenden stickstoff arbeiteten.
anschließend splittete ich meine zellen noch über das wochenende.