Western Blot bezeichnet die übertragung von proteinen auf eine trägermembran.
am anfang goss ich ein gel in eine form aus glasplatten. dieses gel hat kleine taschen, auch slots genannt, in die wir dann später, also nachdem das gel auspolymerisiert war, die lysate vom freitag luden. das ganze wurde dann unter strom gestellt (100-130V) und wegen der elektrophorese wanderten die proteine durch das gel nach unten zum pluspol.
nach zirka 1,5h waren die proteine im gel nach deren größe aufgetrennt. anschließend machte ich einen Semi-Wet Blot. dabei bringt man die proteine auf eine spezielle membran, indem man eine art "sandwich" macht.
zuerst legte ich die membran auf ein filterpapier, das mit puffer angesoffen war. danach holte ich das gel vorsichtig aus den glasplatten und legte es auf die membran. die oberste schicht war wieder ein nasses filterpapier. zum schluss rollte ich noch die luftblasen aus dem "sandwich", das dann noch geladen, also 1h lang geblottet wurde.
danach stellte ich noch eine 5%ige milch her. die ist dazu da, den platz auf der membran an denen keine proteine sitzen mit milchproteinen zu blockieren, da später noch antikörper auf die membran kommen und die sich nicht auf die falsche stelle platzieren sollen
ingesamt kommen zwei antikörper gegen phosphatgruppen von signalmolekülen auf die membran. die membranen haben wir zerschnitten, da sich jeder antikörper nur an proteine bestimmter größe bindet. danach kam die membran in ein falcon in das wir vorher eine 2,5%ige milch und den spezifischen primärantikörper pipettiert haben. wir ließen dann die falcons über nacht bei 4°C rotieren.