Mein letzter Tag begann in der Zellkultur. Dort durfete ich HaCats mit Medium waschen und fürs Ernten vorbereiten. Nach dem Ernten froren wir sie mit Stickstoff ein.


Der Laborfrosch: Eigentlich eine Gelbbauchunke?

Danach beschriftete ich noch einige Gelfotos am Computer und erstellte eine weitere BSA-Eichgerade, da es bei den letzten BSA-Geraden Fehler beim OD-Messen gegeben hat.

Die letzten Schritte der Proteinreinigung:

Als erstes fügten wir alle Proben, in denenn TEV enthalten ist zsammen und brachten sie mitels Dialyse in einen neuen Puffer.



Danach teilten wir die Probe wieder auf 4 Eppis auf und stellet mittels BSA-Eichgerade und OD-Messung die Höhe der Proteinkonzentration fest.

Zum Schluss testeten wir noch die Aktivität der TEV. Dafür mischten wir TEV mit Substrat und trugen die Proben auf ein Gel auf. Darauf konnte man erkennen, wie viel Substrat die neugewonnene TEV im Vergleich zu einer anderen TEV geschnitten hatte.

Für die Proteinreinigung impften wir nun120 ml Medium mit der Über-Nacht-Vorkultur an. Dann inkubierten wir die Kultur auf 37°C bis eine genügend hohe Zelldichte hatte (OD600 bei 0,5).


Als nächstes induzierten wir die TEV-Expression durch Zugabe von IPTG. Die Inkubationstemperations wird auf 30°C reduziert, sodass die Zellen vor allem TEV produzieren und sich kaum mehr teilen. Nach jeweils einer Stunde entnahmen wir eine Probe, mit der wir später überprüfen, wie die Proteinexpression verlaufen ist. Nach 3h ernteten wir die gesamte Kultur ab.

Als nächstes lysierten wir die Proben mit Laemmlipuffer und Ultraschall.

Dann kam die eigentliche Proteinreinigung mittels Affinitäts Chromatografie (Co-Ssepharose). Dabei wurde die Probe mit verschiedenen Puffern gewaschen. Nach jedem Waschen entnahmen wir den Überstand.



Die Proben, die wir aus den Überständen gewonnen hatten trugen wir auf ein Proteingel auf. Darauf wurde sichtbar, in welchen TEV enthalten ist.



In den Wartezeiten ließ ich nocheinmal eine Photoplatte vom Westernblot für 1 Stunde belichten bevor ich sie entwickelte. Durch die längere Belichtungszeit sollen bestimmte Banden noch besser sichtbar werden.

In der Früh habe ich gleich einmal die Membran vom Westernblot mit dem 2. Antiköper behandelt und 2 Filme davon entwickelt.



Dann erstellten wir zwei BSA-Eichgeraden. Diese werden später gebraucht, um zu bestimmen, wie hoch die Proteinkonzentration in der Probe ist.



Zwischendurch setzten wir eine 4ml Vorkultur mit den am Montag transformierten E.colis an.

Heute konnten wir dann nur mehr die Puffer für die Proteinreinigung herstellen.

Am Vormittag durfte ich heute ein Proteingel mit den HaCats-Proben, die wir am Donnerstag geerntet haben, fahren und anschließend mit dem Westernblot beginnen.



Am Nachmittag transformierten wir E.colis (Bl21/LysS) mit TEV-Plasmid und inkubierten sie über Nacht auf 37°C.

Zwischendurch zeigete mir Claudia, wie man Gels mit Einsiedehaut trocknen kann.

Vor dem Labmeeting habe ich heute noch eine Agarosegelelektrophorese mit dem TEV-Plasmid vom Vortag durchgeführt. An dem, wie weit die Bande läuft, sieht man, ob man tatsächlich TEV-Plasmid gewonnen hat.

Danach habe ich die Ligation vom Donnerstag(13.8.) kontrolliert.
Nächste Woche werden wir mit einer TEV-Proteinreinigung beginnen. Wenn noch Zeit bleibt, werden wir vl. auch die Klonierung fortführen.

Da das Ergebnis der Transformation vom Vortag nicht eindeutig ist, habe ich heute die Transformation mit Produkten aus der Ligation, die über Nacht noch einmal gelaufen ist, wiederhohlt.

Am Vormittag habe ich noch die TEV-Plasmidringe mit dem QIAGEN-Plasmid Midi Kit geprept und die Konzentration der Plasmid-DNA gemessen.

Claudia hatte schon am Montag HaCats(mit Dox induzierbare) mit NTAP-Gli1-Plasmidringen transformiert, auf 6-well-Platten ausgesät und am Mittwoch die Hälfte der Proben mit Dox induziert. Das heißt, die Hälfte der Zellen sollten exogenes Gli1 gebildet haben, die andere Hälfte nicht. Heute durfte ich die Zellen mit Laemmli-Puffer ernten und für später tiefkühlen.

Außerdem stand heute eine SDS-Page auf dem Programm.

Beim Reinigen der TAP-getaggten Proteine, kann sich in manchen Fällen IGg von den Sepharose-Kügelchen lösen, die zu Reinigung verwendet werden. Dieses IGg (Imunglobulin G) stört später bei der Massenspektrometrie. Daher hat meine Betreuerin versucht, dieses Ablösen durch eine Vorbehandlung der Sepharose zu verhindern.

Ich durfte beim Vorbereiten der Proben, des Proteingels und bei der anschließenden Silberfärbung helfen.

Zu Beginn habe ich heute das Inset mit Fse I verdaut und anschließend eluiert.

Um uns ein Bild vom Verhältnis der DNA-Konzentration von Insert und Vektor zu machen, fuhren wir dann ein Kontrollgel.

Danach haben wir eine Ligation durchgeführt. Das heißt, Vektor und Insert sollten mit Hilfe einer Ligase wieder zu einem vollständigen Plasmidring zusammengesetz. werden.
Zur Kontrolle haben wir auch eine Religation durchgeführt. Dabei wird versucht, ob sich der Vektor wieder zu einem Ring schließt, wenn man Ligase hinzufügt. Der Vektor sollte ohne Insert nicht schließen.

Für einen Versuch am nächsten Tag haben wir E.colis mit TEV-Plasmid transformiert. TEV wird später für das TAP-tagging benötigt.

Zum Abschluss haben wir E.colis (DH5a) mit dem Ligaseprodukt transformiert. Wenn die Ligation erfolgreich war sollten auf der Platte, auf der die mit dem Ligationsprodukt transformierten E.colis ausgestrichen wurden, Klone wachsen. Auf der Platte, der E.colis, die mit dem Religationsprodukt induzirt wurden, sollten keine Klone wachsen.

Fortsetzung der Klonierung:

Heute habe ich Insert und Vektor mit Fse I verdaut und danach auf ein Agarosegel aufgetragen um die gewünschten Abschnitte von den Stücken zu trennen, die durch den Verdau vom Insert weg bzw. aus dem Vektor herausfallen.

Im Anschluss habe ich wieder beide Proben mit Hilfe des GFX-Kits eluiert.

Diese Woche soll ich (so weit zeitlich möglich) eine komplette Klonierung durchführen. Ziel dieser Klonierung ist es in E. colis C-terminal TAP-getaggtes Sufu zu exprimiern und die Interaktionsstärke zwischen endogenem Sufu und Gli1 mit der Interaktionsstärke zwischen getaggtem Sufu und Gli1 zu vergleichen.

Im ersten Schritt habe ich mittels PCR Inset aus Plasmidringen(P4TO Sufu) für die Klonierung gewonnen. Das Inset enthält die Informationen, die die E.colis brauchen, um das Protein(Sufu), an dessen Interaktionsstärke wir interessiert sind, zu produzieren. Später wollen wir das Inset in einen Vektor einsetzen. Der Vektor ist notwendig, damit die Zellen die Informationen überhaupt ablesen können. Zusätzlich enthält er eine weitere Sequenz(TAP-Tag), die an das Protein(Sufu) angefügt wird, damit es vom endogenen Protein unterschiedenen werden kann und aus der Zellsuspension isoliert werden kann.

Um Vektor und Inset verbinden zu können, muss also auch das Inset mit den selben Enzymen, wie der vektor geschnitten werden. Daher enthalten die Primer für die PCR in diesem Fall nicht nur die Erkennungssequenz, mit der er an den zu replizierende DNA-Sequenz bindet, sondern auch die Schnitstelle von einem der beiden Enzyme(PmeI und FseI) sowie einen Startkodon, der dem Enzym das Schneiden ermöglicht. Durch die PCR wird also nicht nur das Inset gewonnen, sondern es wird auch um die beiden Schnittstellen und die Startkodons verlängert.

Daneben habe ich den Vektor bereits mit dem ersten Enzym( Pme I) verdaut.
Im Anschluss habe ich Inset und Vektor mit Hilfe eines Kits purifiziert.

Heute wiederholten wir den Verdau vom Donnerstag. Diesesmal aber mit einem anderen Enzym, sodass die DNA-Stränge, die man am Ende erhält, länger sind und nicht mehr im selben Bereich wie die RNA laufen.

Am Vormittag haben wir einen Restriktionsverdau mit dem am Mittwoch gewonnen Plasmid durchgeführt. Probleme machte vor allem die RNA, da sie bei der Elektrophorese auf selber Höhe wie eine DNA-Abschnitt läuft. So kann man am Gel nicht erkennen, ob der DNA-Abschnitt aus dem Plasmidring herausgeschnitten wurde, da dieser Bereich von der RNA überdeckt wird.
Da es einige Wartezeiten gab, zeigte mir eine Mitarbeiterin der Arbeitsgruppe, wie man Westernblot-Filme entwickelt.

Am Nachmittag bekam ich noch einige Informationen über die Funktionsweise des hegehog pathways, mit dem sich die Forschungsgruppe beschäftigt. Nebenbei erfuhr ich auch einiges über das Genetikstudium an der UNI Salzburg.

Heute haben wir Plasmid-DNA aus E.colis mittels TENS-Miniprep isoliert.

Danach gab es ein Lab-meeting bei dem jeder seine Arbeit der letzten Woche vorstellt. Auch wenn ich bei weitem nicht alles verstanden habe, bekommt man dabei einen guten Einblick in die Arbeitsweisen und Problemstellungen.

Obwohl ich das Gangsystem noch immer nicht durchschaut habe, komme ich immer dort an, wo ich hin will.
Heute haben wir in einen Restriktionsverdau gemacht. Dazu sollte ich ein bestimmtes Plasmid mit dem Enzym Bgl II und einem weiteren Enzym, das im selben Puffer verdaut, schneiden. Außerdem sollte ich mit Hilfe eines Programms(Vector NT) herausfinden, wie lange die DNA-Stränge, die ich nach dem Verdau erhalte, sein sollten. Ich habe dann mit Bgl II und EcoR I verdaut und anschließend eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt um zu überprüfen, ob Stränge wirklich die richtige Länge haben.


Zwischendurch erklärte mir Claudia Pixner die Spaltung von HaCats (humanen Keratinocyten). Danach durfte ich bei der Arbeit in der Zellkultur in der Sterilbank zusehen.

Um mich nicht im eigenwilligen Gangsystem zu verirren, bin ich an meinem ersten Praktikumstag schon etwas früher in die UNI gekommen. Vor 9 Uhr ist es hier noch etwas ruhiger. Nachdem mir meine Betreuerin Claudia Pixner die Mitglieder der Arbeitsgruppe, in der ich die nächsten drei Wochen mitarbeiten darf, vorgestellt hat, bekam ich eine kürze Führung zu den Büros, zum Labor, zu den Freezern, den Schränken, der Eismaschine und den unterschiedlichen Geräten sowie der Kaffemaschine.

Danach ging es gleich einmal ins Labor. Als erstes machte ich mich mit dem wichtigsten Werkzeug, den Pipetten, vertraut. Dann begannen wir mit dem ersten Versuch: Transformierung kompetenter E. colis.

Zum Abschluss des ersten Praktikumtages erklärte mir meine Betreuerin ein paar grundlegende Dinge zu Plasmiden, E.colis, Restriktionsenzymen und dem Hedgehog-pathway.
http://en.wikipedia.org/wiki/Hedgehog_signaling_pathway
bzw. http://de.wikipedia.org/wiki/Hedgehog-Signalweg