Diese Woche soll ich (so weit zeitlich möglich) eine komplette Klonierung durchführen. Ziel dieser Klonierung ist es in E. colis C-terminal TAP-getaggtes Sufu zu exprimiern und die Interaktionsstärke zwischen endogenem Sufu und Gli1 mit der Interaktionsstärke zwischen getaggtem Sufu und Gli1 zu vergleichen.

Im ersten Schritt habe ich mittels PCR Inset aus Plasmidringen(P4TO Sufu) für die Klonierung gewonnen. Das Inset enthält die Informationen, die die E.colis brauchen, um das Protein(Sufu), an dessen Interaktionsstärke wir interessiert sind, zu produzieren. Später wollen wir das Inset in einen Vektor einsetzen. Der Vektor ist notwendig, damit die Zellen die Informationen überhaupt ablesen können. Zusätzlich enthält er eine weitere Sequenz(TAP-Tag), die an das Protein(Sufu) angefügt wird, damit es vom endogenen Protein unterschiedenen werden kann und aus der Zellsuspension isoliert werden kann.

Um Vektor und Inset verbinden zu können, muss also auch das Inset mit den selben Enzymen, wie der vektor geschnitten werden. Daher enthalten die Primer für die PCR in diesem Fall nicht nur die Erkennungssequenz, mit der er an den zu replizierende DNA-Sequenz bindet, sondern auch die Schnitstelle von einem der beiden Enzyme(PmeI und FseI) sowie einen Startkodon, der dem Enzym das Schneiden ermöglicht. Durch die PCR wird also nicht nur das Inset gewonnen, sondern es wird auch um die beiden Schnittstellen und die Startkodons verlängert.

Daneben habe ich den Vektor bereits mit dem ersten Enzym( Pme I) verdaut.
Im Anschluss habe ich Inset und Vektor mit Hilfe eines Kits purifiziert.