In der dritten und letzten Woche meines Praktikums war ich schon gut eingearbeitet und habe hauptsächlich selbstständig gearbeitet. Am Montag und Dienstag habe ich wieder RNA isoliert, cDNA synthetisiert und anschließend eine realtime PCR gefahren. Diesmal hatte ich MEF (mice embryonic fibroplastes) Zellen, bei denen die Wirkung von Inhibitoren auf Sufu-/- im Hedgehog Signalweg untersucht wurde. Sufu (Supressor of fused) ist ein wichtiger Regulator im Signalweg.
Bei der Auswertung hat sich gezeigt, dass die Positivkontrolle nicht so gut wie erwartet funktioniert hat. Von den unbekannten Inhibitoren hat einer erst ab einer gewissen Konzentration Wirkung gezeigt, der andere hat gut funktioniert.
Am Mittwoch hatte ich nicht viel zu tun, wir haben uns zuerst die Auswertung der realtime PCR angesehen, dann habe ich Zellen geerntet. Dazu habe ich das Medium abgesaugt und dann die Zellen mit Laemmli Puffer bedeckt und damit in Eppis überführt. Bei diesen wird später die Wirkung der Inhibitoren auf Proteinebene (z.B. mit Western Blot) untersucht. Alle Proben waren im Duplikat vorhanden, die six-well plates mit den Duplikaten wurden eingefroren, aus diesen Zellen wird später RNA isoliert werden.
Am Donnerstag und am Freitag durfte ich zum Abschluss noch einmal RNA isolieren und cDNA synthetisieren, für die folgende realtime PCR und das Auswerten der Ergebnisse ist das Praktikum leider zu kurz gewesen ;)
Alles in allem sind die 3 Wochen fast zu schnell vergangen, und ich bin zufrieden mit dem, was ich gelernt und gearbeitet habe.

Letzten Freitag haben Lisa und ich mit den Zellen der Mäuseohren, die Lisa vorher paraffiniert hat, eine HE-Färbung gemacht, das heißt der Zellkern wird mit Hämatoxylin und das Cytoplasma mit Eosin gefärbt. Vorher mussten wir das Paraffin mit Xylen entfernen und die Zellen mit Isopropanol rehydrieren. Das bedeutet, den Container mit den Objekträgern in die Lösung stellen, 5 min warten, dann die nächste Lösung…
Nach dem Rehydrieren wurden die Objekträger mit dest. Wasser gewaschen (3x 3min) und dann für 15 min in die Hämatoxylinlösung gestellt. Danach haben wir sie mit Wasser abgespült und das Eosin mit einer Pipette auf den Zellen getropft. Nach 5 min wurden sie wieder abgespült, danach kam wieder die Isopropanol- und Xylenprozedur. Anschließend hat uns Andrea fertig gefärbte Zellen unterm Mikroskop gezeigt, da bei unseren noch gesundheitsschädliche Xylendämpfe aufstiegen.

Am Mittwoch haben Lisa und ich RNA isoliert. Wir haben dazu erst die Zellen mit dem TRI-Reagent geerntet und in Eppis überführt. Jede hatte 9 Samples zum "bearbeiten". Danach wie gehabt: Phasen trennen mit Chloroform, RNA ausfällen mit Isopropanol, Pellet waschen mit Ethanol, lösen in Hepes/Urea, wieder ausfällen mit Lithiumchlorid, dann 2 Stunden bei -20°C einfrieren. Dazwischen immer wieder Wartezeiten wegen Zentrifugieren...

Nach den 2 Stunden mussten wir die Samples für eine halbe Stunde zentrifugieren, danach 2mal mit Ethanol waschen. Bei einigen Samples war das Pellet nur ganz schwach zu sehen, aber beim Bestimmen der Konzentration mit dem NanoDrop zeigte sich, das überall genügend RNA vorhanden war.

Am Donnerstag haben wir mit der RNA komplementäre DNA synthetisiert. Wir brauchten 2 µg RNA, also haben wir uns mit der Konzentration ausgerechnet, wie viele µl in Wasser gelöster RNA wir in die Tubes pipettieren mussten. Vorher legten wir soviel Wasser vor, dass das Volumen insgesamt 18,5µl beträgt. Dann wurde überall 1µl Primer hinzugegeben, die Tubes wurden für 7min auf 68°C erhitzt, danach auf 25°C abgekühlt.
In der Wartezeit haben wir den Mastermix aus Enzymen vorbereitet, bei dem die Mengen der Bestandteile pro Sample angegeben sind, also mussten wir uns die Gesamtmenge ausrechnen. 10µl vom Mastermix kamen in jedes Sample, dann wurden sie für 80min bei 42°C erhitzt.
Während der Wartezeit haben Lisa und ich eine Zusammenfassung über den HH/GLI Signalweg gelesen und übersetzt (war auf englisch/fachchinesisch).
Später ist es mit der cDNA weitergegangen: Um die Moleküle zu denaturieren wurden 10µl NaOH dazugegeben und auf 70°C erhitzt. Dann wird HCL dazugegeben um die Samples wieder zu neutralisieren.

Mit der cDNA habe ich eine Real-Time PCR gemacht. Ich hatte insgesamt 16 Samples, die ich zuerst 1:10 verdünnen musste (27µl Wasser, 3µl Probe). Zuerst habe ich die Primer (Arp [Houskeeping Gene zum Vergleich] und Gli1) mit dem SYBR Green [in die DNA interkalierender Farbstoff] in die Tubes vorgelegt, dann die verdünnten Samples. Da alles im Duplikat gemacht wurde, waren es insgesamt 64 Tubes, also eine Menge Arbeit… Schließlich war ich dann fertig, habe die Tubes in den Rotor gesteckt und das Programm gestartet.

Wir haben uns dann noch die Auswertung der Real-Time PRC angeschaut, die Lisa und ich vor ein paar Tage gemacht haben.

Zum Schluss habe ich Lisa beim MACS (magnetic activated cell sorting) geholfen. Sie hat vorher schon Proben von Pankreaszellen, von denen einige mit EGF behandelt worden sind mit einem Antikörper behandelt, der an den tumorinjizierenden Zellen bindet. Ein zweiter Antikörper, der am Ende ein magnetisches Anhängsel hat bindet an den ersten. Die Zellen sind durch ein Rohr mit Eisenkügelchen geschickt worden, somit werden die magnetischen von den nicht magnetischen getrennt.
Unter dem Mikroskop hat sich gezeigt, dass der Anteil an Zellen mit dem magnetischen Antikörper sehr klein war.

Heute habe ich wieder unter der sterilen Werkbank gearbeitet. Ich habe die DAOY Zellen ein weiteres Mal gespalten, also schon beinahe Routinearbeit ;) genaueres siehe Bericht vom 4. Tag.

Ansonsten hatte ich nicht viel zu tun, ich habe deshalb Lisa beim Agarosegel Gießen Gesellschaft geleistet.
In einer Wartepause hat uns Wolfi noch einmal die Signalwege in der Zelle, die in dieser Forschungsgruppe untersucht werden, erklärt.

Heute war ein eher kurzer Tag. Da Wolfi auf einer Besprechung war, habe ich zuerst Lisa dabei geholfen, eine Real-Time PCR zu pipettieren. Dabei habe ich zuerst die 3 Primer in 3 Eppis mit SYBR Green vermischt und dann in die Röhrchen im PCR-Block gegeben. Lisa hat dann die 1:10 mit Wasser verdünnte cDNA pipettiert.
Anschließend ist es mit dem Westernblot weitergegangen: Die Membran mit den Proteinbanden ist über Nacht mit Antikörpern behandelt worden, die an die Proteine binden. An den Antikörpern ist ein Enzym, das ein Lichtsignal aussendet. Wir haben die Membran zuerst mit einer Substanz behandelt, dann sind wir in die Dunkelkammer gegangen, wo wir die Lichtsignale detektieren konnten. Das Fotopapier wurde zuerst auf die Membran gelegt, nach einer Minute entfernt und im Entwicklerbad geschwenkt. Dann wurde es mit dem Stabilisator fixiert und mit Wasser abgespült.
Bei einer Membran waren viele unspezifisch gebundene Antikörper, bei einer anderen waren die Signale nur ganz schwach zu sehen, die haben wir dann noch länger in der Dunkelkammer gelassen.