Mein letzer Tag

(wird noch dazugefügt)

Elektronenmikroskopie

- 30 min bei 4°C zentrifugieren
- Pellet in 1 ml Solution A und 1 ml Isopropanol (anstatt EtOH zum Ausfallen v. DNA) aufnehmen
- 15 min Inkubation bei RT
- 15 min bei 4°C zentrifugieren
- Pellet mit 70% EtOH waschen und n ochmals Z
- Pellet in DEPC-Wasser oder FA aufnehmen
wenn erfolg -> Northernblot geplant

Transfektion von Zellen:

In 12 wells:
- use 50-200 (usually 40-100) pmol DNA/RNA in 100 µl OPTIMEM
- use 2 µl 'Lipofectamine 2000' in 100 µl OPTIMEM, 5 min at RT
- add nucleic acid solution dropwise to Lipofectamine solution, then add 1 µl fluorescent plasmid, 20 min RT
- add mixtrure dropwise in 1 ml medium directly on cells
- change medium after 4-6 h to reduce possible cytotoxic effects


Miniprep,

RNA Extraktion aus Zellen:
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- Zellen trypsinisieren, waschen und ich ein Falcon-Gefaess pelettieren (2 min zentrifugieren, 1000 rpm)
- Pellet resuspendieren und nach ueberfuehrung in Eppi wiegen (in unserem fall HeLa: 0,2 g)
- Zugabe von 5 ml Extraktionsloesung pro 1 g Zellen
- Homogenisieren (Vortex, Triturieren)
- Zugabe von 1/10 Volumen CI (Chloroform:Isoamylalkohol 24:1) und 1/20 Volumen 2M (2 Mol pro Liter) NaAc (pH 4,2) -> gut mixen und 10 min fullspeed Z
- waessrige Phase in Corex-Glastube ueberfuehren, 3 Vol. 100% EtOH zugeben und ueber Nacht bei -20°C fallen

Caesar konnte es, Cicero ebenfalls und Napoleon behauptete es auch ganz gerne von sich... (man sieht was dabei rauskam). Die Rede ist von Multitasking, worin ich langsam trainiert werde!
Heute Nachmittag hatte ich Northern blotting, UV-chamber, Hot lab (Isotopenlabor) und meine guten Zellen zur selben Zeit!
Soll heissen: waehrend das eine mit Elektrizitaet, Trypsin oder Licht versorgt wurde, vesuchte ich so vielen Themen wie moeglich zu folegen und hinterher nicht die Zellen ins Hot Lab oder das Trypsin statt in den Kuehlschrank in die Mikrowelle zu stellen!

Vormittags war ich mit Katrin im Zuge der Immunfluoreszenz am Mikroskop, was unglaublich faszinierend war. Da ich in einem RNA-Labor (mit viel Biochemie) bin, habe ich meistens mit Fluessigkeiten oder Gelen - in jeden Fall aber winzig kleinen, eben mikroskopischen Partikeln zu tun, unter dem Lichtmikroskop bekamen diese Substanzen dann ploetzlich ein Gesicht! Durch die vorher dazugefuegten Farbstoffe leuchteten verschiedene Stoffe unterschiedlich, sodass ich wirklich den Aufbau der Zellen sehen konnte - Chromosomen, Proteine, Cytoskelett... Es war wirklich spannend, zu sehen, woraus wir Menschen (und alle anderen Lebewesen natuerlich auch) bestehen; sozusagen unsere "Bausteine" zu beobachten!!!

Zu guter Letzt ein ganz anderes Thema:
Wir hatten eine Sicherheitsbegehung, dh eine Kontrolle, ob alle Substanzen, mit denen wir arbeiten auch sachgemaess verstaut sind, oder im Labor Speisen anzutreffen sind, das Isotopenlab richtig ausgeruestet ist etc.

Immunofluorescence in HeLa-cells
Splitten von Zellen (Hilfe, das Medium wird knapp!!!!!)
Northern blotting

Mein erster echter Einblick in die entspannende Taetigkeit des Multitasking war... nun ja... vielfaeltig!
In einer Minute Zellen splitten, dann wieder (waehrend die guten im Trypsin ausharren) die kurze Geschichte des Northern-blots erzaehlt bekommen, danach die Zellen mit frischem DMEM vor der endgueltigen Verdauung erloesen und irgendwann dazwischen die Fortfuehrung der Immunofluoreszenz... kurz gesagt, meine Notizen waren unleserlich und vor allem unzusammenhaengend!
Hierbei gleich vielen dank an Katrin fuer das Protokoll, ich haette ohne ein ziemliches Problem (gehabt)!

Immunofluorescence day two (immunoreaction):
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- check cell growth in light microscope, cells must not be too dense
- take 12 well plate out and work on bench
- wash cells twice with 1 ml 1x PBS
- fix cells with 800 µl 3% PFA (Paraformaldehyde) for 20 min on room temperature (RT)
- rinse twice with 1 ml 1x PBS
- permeabilize cells with 800 µl 0,3% Triton in 1x PBS for 5 min on ice
- then wash 3 times with 1 ml 1x PBS
- block with 800 µl 3% BSA for 30 - 60 min on shaker (RT)
- incubate 1st antibody diluted in 3% BSA either in wet chamber or in wells for 40 min
* wet chamber:
wet paper in chamber with dH2O and put parafilm in chamber
put 100 µl antibody drops on parafilm
* in wells:
when enough antibody is present incubate 800 µl of antibody dilution
- wash 3 times with 0,1% BSA, 5 min each (in case of incubation in wet chamber, the cover slips are now moved to wells again for washing procedure) > 1 ml
- incubate 800 µl of 2nd antibody diluted in 3% BSA for 40 min (concentr. 1:1000)
antibody is sensitive to light
spin down antibody at 13.000 rpm for 5 min before use and take only supernatend
- was 3 times with 0,1% BSA, 5 min each
- incubate DAPI at a final concentration of 0,2 µl/ml (dilute stock 1 mg/ml 1:10.000 in 0,1% BSA) 5 min
- wash twice with 1x PBS and once with dH2O
- put 1 µl vectashield onto slide and put cover slip upside down onto slides, let dry and seal with nail polish

heute war ich zum ersten Mal bei einem Lab-Meeting dabei (davor war Sommerpause), was ziemlich interessant und witzig war, weil einerseits wichtige Themen (Budget, Proben, Versuche etc.) behandelt wurden - andererseits liess sich jeder ein nettes Fruehstueck schmecken...

Danach habe ich mich wieder an eine Miniprep gemacht, ohne Komplikationen und Schneckentempo :-)

Am Nachmittag haben Katrin und ich schliesslich mit Immunofluoreszenz in HeLa-Zellen begonnen:

Immunofluorescence in HeLa cells (Protokoll)
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Day one; grow HeLa cells on cover slips:

- take a 12 well plate
- trypsinate 10 cm confluent HeLa cell dish
* wash plate once with PBS
* add 1 ml trypsin and mix gently, then suck off trypsin
* add 0,5 ml trypsin and incubate an 37°C for ~ 3 min
* sop trypsination by adding a proper amount of DMEM + 10% FCS (ie 11,5 ml)
- split cells onto cover slips in 12 well plate:
put one 18 mm round cover slip in each well
800 µl fresh DMEM + 10% FCS (fetal cow serum) in each well onto cover slip
add 200 µl cell suspension
- strongly move plate to avoid cell clustering in the middle of the plate
- incubate on 37°C
- strongly move plate again after ~ 20 min
- incubate on 37°C overnight

(Kommt noch, Nachtrag EM)
eigene Zellen splitten

Die naechsten 3 Tage bin ich wieder ein neues 'Anhaengsel', diesmal von Gregor, im Gebiet Zellbiologie und Bioinformatik.

Am Vormittag war GoTV hier, um eine Art Dokumentation der IMBA-'Summerschueler' zu machen, wir wurden alle interviewt, dann kamen auch die jeweiligen Betreuer zu Wort.
Da das meine erste echte Erfahrung mit dem Fernsehen war, hatte ich ein recht mulmiges gefuehl im Magen und der Satz "Schau nicht auf die Kamera, die ist gar nicht da" ist gar nicht so leicht zu befolgen.
Letztendlich habe ich aber diese halbe Stunde ueberlebt und im nachhinein betrachtet war es ueberhaupt nicht schlimm!

Heute war eine Art 'Fenstertag", dh nicht viel los, ich habe meine (eigenen) Zellen gesplittet und unter dem Mikroskop beobachtet, es klappt schon ganz gut und sie leben noch!

Krebsforschung,
Zellen splitten,
Westernblot,
Miniprep
Maushaus
Hämatopoetische Differenzierung
Mikroskopie

8. August 2006: (Tag 6)
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Am Vormittag hat mir Christoph in Collagen wachsende Krebszellen gezeigt (3 dimensional), anschliessend hatte ich die Gelegenheit (auch im IMP) bei einem Westernblot (Protein blotting) zuzusehen.
Das kann man auf zwei verschiedene Arten machen, capillary blotting oder electroblotting, in diesem Fall war es der Vorgang des "Elektroblottens".

(erklaerung folgt)

9. August: (Tag 7)
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Wie immer im IMP, anschliessend eine Miniprep, die gar nicht mehr so mini war und letzten Endes doch das Maushaus.
Ich erfuhr ziemlich viel von Maeusen, auch einiges darueber, dass es ohne Versuchstiere (ob Fliegen, Kaninchen oder Gorillas) keine medizinische Forschung gibt; leider.
Zwecks Infektionsgefahr war sterile Kleidung notwending, ein langer blauer Kittel, Plastik ueber den Schuhen, Gummihandschuhe, Haarabdeckung und auch eine Feinstaubmaske. Die Maeuse selbst waren wie erwartet ziemlich herzig, und tun mir immer noch ziemlich leid...
Allerdings ist es, so unangenehm es auch sein mag, notwendig und bei weitem sinnvoller als Tierversuche in der Kosmetikindustrie!
Nach dieser Erfahrung bin ich mir ziemlich sicher, dass meine berufliche Zukunft nicht im Maushaus liegt, ich bereue den Besuch jedoch nicht, denn man sollte alles selbst sehen um sich ein Bild machen zu koennen (Erzaehlungen reichen oft nicht oder verzerren den Eindruck)!

10. August: (Tag 8)
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Heute habe ich eine eigenes "Miniprojekt" bekommen, naemlich Zellen bis Ende meines Praktikums zu "betreuen" und am Leben zu erhalten.
Ich habe zwei verschiedene Arten bekommen, H4 (Brust-) und 293E- Zellen.
Langsam bekomme ich Uebung im Splitten...

Miniprep
PCR
Krebsforschung
Zellen (Mikroskop)

Von Montag bis Freitag werde ich ein neuer "Schatten" sein, diesmal von Christoph, der mir das Gebiet der Krebsforschung und Zell- bzw. Molekularbiologie naeher bringen wird.

Heute (Mo) war ich das ersten Mal im IMP (Institute of Molecular Pathology), genauer gesagt in einem kleinen Labor, vollgestopft mit Zellen und Utensilien zu deren Auswertung. Anfangs musste ich ziemlich oft hin und her eilen, um nicht andauernd im Weg zu stehen (was, nebenbei erwaehnt, ausgesprochen leicht war), irgendwann hatte ich dann Uebung, vorauszuahnen, wo wer demnaechst hin moechte!
Vormittags bekam ich Einblick in verschiedene Petrischalen mit unterschiedlichen Zellen und Naehrmedien, sowie in ein Computerprogramm, welches das Photographieren von Zellen moeglich macht.
Am Nachmittag durfte ich meine erste eigene Miniprep machen, und eine PCR unter die Lupe nehmen.

Miniprep:
Bereits vorbehandelte Bakterien (Plasmid) aus einer Over-night-culture wurden abzentrifugiert, der Ueberstand fiel dabei weg, und mit drei verschiedenen Puffern behandelt.
Zuerst P1, dann P2, dann N3 (haben die Funktion des Reinigens und Loesens der DNA), dann in die Zentrifuge. Anschliessend kommt ein Waschpuffer, sowie ein Lysispuffer dazu, am Ende hat man die DNA als kleines Troepfchen im Eppendorfroehrchen.

PCR - Polymerase chain reaction:
Plasmid (Template) von letzter Woche (Transformation)
Puffer (auf das Enzym zugeschnitten; Salze etc.)
dNTP mix (Nukleotidmix)
Primerr (forward & reverse) - Anfangs- und Endteil der DNA-Sequenz, bzw. des Teils das man amplifizieren will
Enzym (Polymerase) -> sensibelste Komponente, wird zuletzt hinzugefuegt und muss auf Eis gelagert werden
Wasser (um das Volumen gleichzuhalten)
Thermocycler
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Alles wird zusammengemischt und in den thermocycler gesteckt, der erhoeht und senkt seine Temperatur abwechselnd von anfangs 2 min Denaturation bei 94oC, dann zu 55oC Annealing und 72oC Elongation.
Je nach Einstellung passiert das verschieden oft, in unserem Fall 30 Mal, so oft wird das Plasmid vervielfaeltigt!

Ich habe gestern mit Jutta (medizinisch-technische Assistentin) den versuch des Zellen splitten gemacht - was folgendermaßen abläuft:
Ist eine Petrischale voll (von Zellen) oder die Nährlösung verbraucht, stellen die darauf kultivierten Zellen ihr Wachstum ein und sterben nach einiger Zeit ab. Ist das nicht erwünscht, "splittet" man, das heißt, man überträgt den Inhalt einer Petrischale (oder Tube, etc.) auf mehrere neue, sodass die Zellen mehr Platz und frische Nährlösung haben und ihrer weiteren Vermehrung nichts im Wege steht.
In unserem Fall haben wir HeLa-Zellen verwendet und den nhalt einer Platte auf fünf aufgeteilt.
Medium:
DMEM w/o (=without; ohne) Glutamine
10 % PBS
P/S (Penicillin/Stryptomycin) - Antibiotikum
Glut
Hepes (Puffer)

Durchführung:
Handschuhe anziehen, desinfizieren und den Deckel der Petrischale abnehmen. Die Zellen wachsen auf dem Boden, daher können in der Nährflüssigkeit nur tote Zellen sein (losgelöst) - zuerst ist es wichtig, den Überstand mit ebenjenen abgestorbenen Zellen abzusaugen.
Dann kommt ein Spüldurchgang mit 10 ml PBS, bei dem die letzten eventuellen Rückstände entfernt werden, die lebenden Zellen werden nicht geschädigt.
Nun gibt man 1 ml Trypsin (ein Verdauungsenzym) dazu und "wäscht" die Petrischale; "schlappe" Zellen werden hierbei anverdaut, vom Boden gelöst und vom gesunden Stamm getrennt. Als nächstes gibt man den Zellen 0,5 ml Trypsin bei und stellt sie in den Brutschrank - das Trypsin verdaut die Zellen an und löst sie dabei vom Untergrund. (in unserem Fall ~ 3 min bei 37°C)
Nach dem Herausnehmen kommen 10 ml DMEM dazu (homogene Mischung), dadurch verliert das Trypsin seine Wirkung.
An dieser Stelle haben wir in jede der fünf Petrischalen 8 ml DMEM vorgelegt und dazu 2 ml des "Urzellen"-Extraktes gegeben.
Die neuen Petrischalen mit den Zellen kommen wieder in den Brutschrank (bei 37°C), in zwei Tagen werden sich die Zellen soweit vervielfältigt haben, dass sie wieder verdünnt werden müssen.

Man sagt ja, dass der erste Eindruck gemeinhin der wichtigste ist - in "meinem" Lab könnte er besser nicht sein. Als Resumee der ersten Woche lässt sich folgendes sagen:
Die Stimmung im Labor ist locker-entspannt, die Menschen sind wirklich nett, beantworten meine zahlreichen Fragen (manchmal auch im Mitschreibetempo), erklären mir alles genau, wie und warum etwas auf bestimmte Art funktioniert und tun alles, um mir ihr Fachgebiet näher zu bringen.
Vielen, vielen Dank, es ist großartig!!!