Heute haben wir die Proben vom Freitag gescant und mikrodisektiert.
Außerdem hab ich noch mit meiner Forschungskokumentation angefangen. Sonst ist heute nicht viel passiert :-)

Der heutige Tag war sehr interessant. Am Vormittag haben wir lange über PCR geredet und über die verschiedenen Methoden. Außerdem habe ich etwas über die Vorgänge in den Zellen gelernt.

Es gibt ganz verschiedene Methoden der PCR. Z.B. kann man mit hilfe von Viren Polymerase das gesamte Erbmaterial amplivizieren.

Am Nachmittag habe ich eine weitere IF Färbung auf einem ISET Filter gemacht.

Sooo.... Nach langem werd ich mal wieder nachholen, was ich die letzten Tage so gemacht habe.

Ich habe die IF Färbung mit dem MNF 116 Antikörper auf einem ISET Filter gemacht, den ich zuvor mit etwas Fotokleber auf einen OT geklebt habe. Da diese Färbung etwas Zeit in Anspruch nimmt habe ich die Pausen immer wieder für "Nachforschungen" im Internet verwendet.

Am Nachmittag haben wir wieder mikrodissekteirt und eine PCR gemacht.

Eigendlich wollten wir Zellen auf ISET Filtern färben, doch da wir die Filter erst ziemlich spät bekommen haben, werden wir das heute nachholen.

Wir haben dann weiter die Daten der PCR angeschaut und ausgewertet und mit den Ergebnissen eine kleine PowerPoint Präsentation gemacht. Uns ist aufgefallen, dass bei den SW-480 Zellen (Krebszellen!) beistens nur ein Peak (Ausschlag im Diagramm) bei dem Elektropherogramm kommt (eigendlich sollten es ja zwei sein, da wir im Körper ja auch immer Chromosomenpaare haben). Wir sind dann zu dem Schluss gekommen, dass diese Zellen für derartige Versuche nicht optimal eignen, da in den Zellen bereits Abbauprozesse stadtfinden und es deshalb nur zu einem Peak kommt.

Heute haben wir die PCR Ergebnisse ausgewertet und sind zu dem Schluss gekommen, dass die PCR sowohl bei einzelnen, als auch gepoolten Zellen sehr gut funktioniert. Weiters ist es möglich, auch IF und IHC gefärbte und fixierte Zellen mittels PCR zu untersuchen.
Man konnte auch sehr gut den Unterschied der DNA zwischen den verschiedenen Zelltypen (also SW-480 und den Blutzellen) erkennen. Weiters stellten weder die Membran, noch der ISET Filter ein Problem dar.

Probleme hatten wir nur mit einzel Zellen in dem Eppis, da warscheinlich die Volumina der PCR Lösungen zu groß waren, für so wenig Ausgangsmaterial.

Weiters können wir sagen, dass die IHC Färbung am ISET Filter zwar möglich ist, sich aber nicht wirklich auszahlt, da sie sehr umständlich ist und im Endeffekt nicht mit der Software des Mikroskops detektieren lässt.
Deswegen werden wir morgen versuchen, eine IF Färbung am Filter durchzuführen und ihn anschließend scanen.

Nach einem langen, erholsamen Wochenende geht es jetzt wieder frisch ans Werk.

Wir haben nun die PCR Produkte von den AmpliGrids (Thomas hat noch ein paar gemacht) aufgereinigt, da ja noch das ganze Öl und so weiter drauf war. Das funktioniert über einen fertigen Kit, den es zu kaufen gibt, und wiederholtes zentrifugieren.
Weiters wurden die Produkte aus den Eppis aufbereitet.
Die fertigen Proben wurden anschließend in eine spezielle Platte eingefüllt und mittels Kapillarelektrophorese analysiert. Das ist ein Gerät, welches mit 46 Kapillaren arbeitet, in denen sich die DNA hochsaugt. Ein spezieller Detektor erkennt, wenn DNA vorbei kommt und gibt das Signal an einen Computer weiter, der die Daten über ein Diagramm ausspuckt.

Wir haben eine spezielle PCR Methode verwendet, welche sich PP16 (Powerplex 16) nennt. Dabei wird die DNA an 16 verschiedenen Stellen angeschaut, an welchen sich gewisse Muster immer wieder wiederholen. Z.B.: ATATATATATAT... An diesen Stellen kommt es oft vor, dass die Polymerase in unserem Körper nicht richtig arbeitet und so bei einer Vererbung diese Wiederholung nicht z.B. 10 mal sonern 15 mal amplifiziert. So ergibt sich bei jedem Menschen ein anderes Muster.
An genau diesen Stellen können wir uns die DNA anschauen und die Wiederholungen zählen, um so verschiedene Zellen auseinander zu kennen, denn die Warscheinlichkeit, dass zwei Menschen, die nicht miteinander verwandt sind, das selbe Muster besitzen ist sehr, sehr gering.
Dieses Verfahren ist übrigens das selbe wie das, dass bei Vaterschaftstests und in der Serie CSI oft durchgeführt wird.

Da ich bis heute leider keine Zeit hatte, den Donnerstag zu dokumentieren, werde ich das heute nachholen.

Wir haben die, am Mittwoch gefärbten SW 480 Zellen auf dem Membran OT mittels der Software R.C.Detect gescant, um danach beim Mikrodisectieren die positiven Zellen leichter zu finden. Das Programm scant den gesamten Objektträger und sucht mit verschiedenfärbigen Licht nach Fluoriszenzfarben, mit welchen ja am Vortag die positiven Zellen gefärbt wurden. Weiters merkt es sich die Position der Zellen und man kann sie im Anschluss sofort mit dem Laser mikrodisektieren.

Da wir ja schon schlechte Erfahrungen mit der on- chip PCR gemacht haben, haben wir beschlossen, die PCR in Eppis, also kleinen Reaktionsgefäßen, durchzuführen. Dazu wurden immer 10 mykroliter der PCR Lösung in den Deckel des Eppis gegeben, und die Zellen dann direkt hinein geschossen. Anschließend wurden sie in einen herkömlichen Thermocycler gegeben.
Insgesamt haben wir so 15 Proben gewonnen. Wieder von gepoolten und einzel Zellen, jeweils gefärbt und ungefärbt. Zusätzlich wieder positiv und negativ Kontrolle.

Wir haben heute die gestern gefärbten SW 480 Zellen verarbeitet, indem wir sie zuerst mikrodisektiert haben. Das bedeutet, dass wir sie mit einem Mikroskop gesucht, und anschließend mit einem Laser auf einen AmpliGrid (OT, der an den meisten Stellen Wasser abweisend beschichtet ist und nur in kleinen Kreisen das Wasser aufnimmt) Objektträger geschossen haben.

Insgesamt haben wir so 16 Proben bekommen: 4 gefärbte im Pool (also mehrere auf einem Haufen), 3 einzelne ungefärbte, 1 mit negativen Zellen (also Zellen, die sich nicht gefärbt haben, und so warscheinlich keine SW480 Zellen sind), 4 ungefärbt im Pool und 4 einzelne ungefärbte.
Zusätzlich haben wir noch eine negativ und eine positiv Kontrolle zur überprüfung der Ergebnisse gemacht.

Anschließend wurde mit den Proben eine PCR (Polymerase Chain Reaktion) durchgeführt.
Das ist eine Methode, die dazu verwendet wird, mit Hilfe von so genannten Primern und der Polymerase, eine genau festgelegte Sequenz innerhalb der DNA zu vervielfachen. Das geschieht, indem man die DNA erhitzt, und somit der Doppelstrang wie ein Reisverschluss auseinander geht. Anschließend setzen sich die Primer an der DNA an und die Polymerase vervollständigt den Einzelstrang dann wieder. Dieser ganze Vorgang wird ständig in einem Thermocycler (= ein Gerät, welches immer die richtige Themperatur für die derzeitigen Phasen einstellt) wiederholt.

In userem Fall führten wir die PCR für die 18 Proben auf einem OT durch (on-chip PCR). Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, dass es mit viel kleineren Volumina als die herkömliche PCR arbeiten kann, und somit Kosten einspart (herkömliche PCR arbeitet mit 50 microL, on-chip PCR mit 1microL Polymerase).
Leider sind während unserer Reaktion große Luftblasen innerhalb der Flüssigkeiten entstanden, sodass 12 Proben kaputt wurden. Als Konsequenz werden wir das ganze morgen nochmal mit der anderen Methode durchführen.

Weiters durfte ich heute SW 480 Zellen auf einem Membran OT mit einem Cytokeratin Farbstoff einfärben, um sie morgen einer weiteren PCR zu unterziehen.