Das Antigen, das unter anderem das gewünschte Epitop trägt, wird zuerst einer Maus in die Milz gespritzt.
Das Tier entwickelt in spezifischen B-Zellen Antikörper gegen die Epitope.

Diese B-Zellen werden entnommen und mit Myelomzellen (also Tumorzellen) fusioniert, sie werden zu sogenannten Hybridomazellen, die sich ewig teilen können.
Dazu gibt man sie in Polyethylenglykol, das die Zellwände auflöst.
Dabei fusionieren aber nicht nur B-Zellen mit Myelomzellen, sondern auch einzelne Zelltypen untereinander. Um diese unerwünschten Zellen loszuwerden, mengt man ein selektives Medium (in unserem Fall HAT) bei.
Da nur B-Lymphozyten ein Enzym besitzen, das ihnen ermöglicht, dem Medium standzuhalten, sterben Myelomzellkombinationen langsam ab.
B-Zellen-Kombinationen ohne Tumorzellen sterben ohnehin früher oder später, da ihre Teilungsfähigkeit nur begrenzt ist.
So können nur „richtig“ fusionierte Zellen überleben.

Die Lösung wird nun verdünnt und so in mehrere „Wells“ aufgetragen, dass in jedem Well lediglich eine Zelle liegt.
Jetzt werden die Hybridomazellen einzeln auf unser Antigen getestet. Ist das Ergebnis positiv, haben wir eine ewig lebende B-Zelle gefunden, die spezifische Antikörper zu unserem gesuchten Epitop produziert.

Was sind ANTIGENE?
Antigene sind Proteine, die potentiell die Bildung von Antikörpern anregen.

Was sind ANTIKÖRPER?
Antikörper sind Proteine, die an die ihre Bildung anregenden Antigene gebunden werden. Diese verfügen über sogenannte Epitope, die jeweils spezifisch von einer Art von Antikörpern gebunden werden.
• P o l y k l o n a l e Antikörper sind gegen mehrere Epitope/Antigene gerichtet.
• M o n o k l o n a l e Antikörper sind nur gegen ein Epitop/Antigen gerichtet.

Da 50 % des embryonalen Genoms vom Vater stammt, stellt der sich implantierende Embryo fremdes Gewebe dar, das im Prinzip vom mütterlichen Organismus abgestoßen werden müsste.

Es gibt mehrere Hypothesen zu der Frage, warum der Konzeptus nicht abgestoßen wird.
Eine Möglichkeit ist die Resistenz des Synzytiotrophoblasten gegenüber mütterlichen Killerzellen oder das Fehlen von Transplantationsantigenen auf der Oberfläche des Synzytiotrophoblasten.

Bei Autoimmunerkrankungen der Mutter wird der Embryo aufgrund von spezifischen Antikörpern abgestoßen, die durch Krankheiten entstehen und sekundär den Konzeptus angreifen.

Um die Einnistungsstelle herum sind die mütterlichen Kapillargefäße gestaut und erweitert.
Es bilden sich Sinusoide aus.

Die Synzytiumzellen dringen tiefer in das Stroma ein und beginnen, die endotheliale Auskleidung der mütterlichen Sinusoide zu zerstören.
Mütterliches Blut tritt in das Lakunensystem über.
Mit dem weiteren Eindringen des Trophoblasten in das Stroma werden mehr und mehr Bluträume eröffnet, und an vielen Stellen entwickeln sich Verbindungen zwischen den Lakunen und dem arteriellen oder venösen Teil des mütterlichen Kreislaufsystems.

Infolge der Druckdifferenz zwischen arteriellen und venösen Kapillaren beginnt das mütterliche Blut durch die Trophoblastlakunen zu fließen.
Damit ist der uteroplazentare Kreislauf entstanden.

Am 3. Tag nach der Befruchtung erreicht die Zygote (befruchtete Eizelle) im 12- bis 16-Zellen-Stadium als Morula die Gebärmutterhöhle.

Aus der Morula wird die Blastozyste (16- bis 64-Zell-Stadium). Deren Zellen gliedern sich in eine äußere Zellmasse, aus der der Trophoblast hervorgeht, und in eine innere Zellmasse, aus der der eigentliche Embryo entsteht (Embryoblast).
Zwischen dem 5. und 6. Tag heftet sich die Blastozyste an die Gebärmutterschleimhaut an.

Am 8. Entwicklungstag ist sie schon teilweise in das Stroma des Endometriums eingebettet. Sie dringt mit dem embryonalen Pol, das heißt mit dem Bereich, in dem der Embryoblast liegt, weiter in die Schleimhaut ein.

Im Kontakt mit der Schleimhaut verdickt sich der Trophoblast. Im verdickten Bereich besteht er aus einer inneren Schicht mit einkernigen Zellen, dem Zytotrophoblast, und einer äußeren, vielkernigen Schicht ohne klare Zellgrenzen, dem Synzytiotrophoblast oder dem Synzytium.

Der Synzytiotrophoblast ist für die Hormonproduktion verantwortlich. Das wichtigste Hormon ist das HCG (humanes Choriongonadotropin).
Am Ende der 2. Woche wird soviel HCG produziert, dass es als Schwangerschaftstest mit einem Radioimmunessay nachgewiesen werden kann.

Die meisten Gruppen forschen an fetalen Erythroblasten im Blut der Mutter, kernhältigen Vorläufern der kernlosen Erythrozyten (Rote Blutkörperchen), die ungefähr die Hälfte der Erythroblasten im Blut einer Schwangeren ausmachen.
Nach dem ersten Trimenon (Drittel der Schwangerschaft) liegt ihre Konzentration bei etwas über einer Zelle pro ml Blut.

Von den mütterlichen Erythroblasten unterschieden werden die fetalen durch die Detektion von ε-Globin, das in den Hämoglobinmolekülen im Gegensatz zu einem Erwachsenen (98 % α- und β-Ketten) in der frühen Fetalphase vorherrscht.

In der Immunhistochemie nutzt man die Spezifität von Antikörpern, um die Verteilung von Antigenen z.B. an einem histologischen Schnitt sichtbar zu machen.
Das Verfahren wird zur Identifizierung bestimmter Zelltypen, Zellstrukturen oder Zellprodukte angewandt.

Grundlage der Immunhistochemie ist die ANTIGEN-ANTIKÖRPER-REAKTION.

Man benützt dabei zumeist monoklonale Antikörper, also Antikörper, die nur mit einem bestimmten Epitop des Antigens reagieren.

Der histologische Schnitt wird aufgetaut und dann in Aceton fixiert (2 min).
In PBS wird er rehydriert (osmotischer Druck), zwischen den einzelnen Protokollschritten wird der Objektträger mit PBS gewaschen.

Damit die Antikörper später nur spezifisch binden (Fab-Enden), wird durch Blocken mit humanem AB-Serum die unspezifische Bindung (Fc-Ende) verhindert.

Auf den Schnitt wird eine Primärantikörper-Lösung aufgetragen. Die Primärantikörper (von der Maus) setzen sich an den Epitopen der Antigene fest.

Der Sekundärantikörper (bei uns goat anti-mouse), der an den ersten binden kann, ist mit Biotin konjugiert.
Die Methode basiert auf der Fähigkeit des Glykoproteins Avidin, vier Moleküle des Vitamins Biotin zu binden.

Das dritte Reagenz ist ein Peroxidase-konjugierter Streptavidin-Komplex, der die Bindung an das Biotin des Sekundärantikörpers ermöglicht. Das Enzym Peroxidase – und damit das gesuchte Antigen – wird mit einem geeigneten Chromogen (in unserem Fall AEC) sichtbar gemacht.


Generell unterscheidet man eine direkte und eine indirekte Methode (je nach dem, ob die Peroxidase schon an den Primär-, oder erst an den Sekundär-Antikörper gekoppelt ist).

Derzeit werden bei Risikoschwangerschaften (Frauen über 35, bekannte Erbdefekte,…) mit der Chorionzottenbiopsie und der Amniozentese (Fruchtwasseruntersuchung) ausschließlich sogenannte INVASIVE Methoden verwendet, um einen Gendefekt des Kindes mit Sicherheit diagnostizieren zu können.
Diese aber bergen immer noch ein zwar kleines, doch konstantes Risiko für die Schwangerschaft. Durch die Amniozentese beispielsweise erhöht sich das Risiko einer anschließenden Fehlgeburt auf 0,5 %.

Das Ziel unseres Forschungsprojektes ist, HALB- und
NICHTINVASIVE Methoden zur Pränataldiagnostik zu entwickeln.
Drei Ansätze werden dabei zurzeit erprobt:
• E r y t h r o b l a s t e n : nichtinvasiv, aus dem Blut der Mutter
• T r o p h o b l a s t e n : nichtinvasiv, aus dem Blut der Mutter
• Z e r v i k a l s c h l e i m a u s s t r i c h : halbinvasiv

Zusammen da Kristina, dem Tom, da reizenden Mag. Chrisi (sprich: Chrissi) Anderle, und meiner nicht weniger reizenden Praktikumskollegin Prisca (latÄÄnisch, wieder wos für mei Klass) aus Fürstenföld (Hommage à la Hongrie, Nora), geht's zurzeit um a Verfahren der Pränataldiagnostik, mit dem ma sich die Fruchtwasseruntersuchung (Amniozentese) schenken kinnad.
Im Gegensatz zu ana Amniozentese (invasiv) warad diese neue, non-invasive Methode risikofrei: ma würd nur mehr da Mutter Blut abnehmen, noch Tropho- oder Erythroblasten vom Kind (stammen aus der Plazenta) suchen und die dann analysieren müssen.
Großes Problem: es schwimmen zu wenige solche Zellen im Blut der Mutter.
Um die Methode amoi so auszutesten, wern hoit jetzt nu imma künstlich Tropho- und Erythroblasten von ana Schwangerschaft in a fremdes Blut gemengt (de Prisca lässt do öfters ihrs).
Echt interessantes Thema, mehr dazu gibt's in Bälde in meiner Forschungsdokumentation.