Meggies Webblog

Heute habe ich die Konzentration von meinem neuen Vektor DRE in UBI-myc gemessen. Am Vortag hatte ich eine Ligation durchgeführt, wo die DNA DRE in den Vektor UBI- myc einegführt wurde. Nun wollte ich die Konzentration der neuen DNA herausfinden. Leider lag diese sehr niedrig.

Außerdem habe ich 2 Bakterienkulturen angesetzt, die über die Nacht wachsen können und zwar mit der DNA 14 und DRE.

Als nächstes habe ich abermals eine RT-PCR gemacht. Wieder wurde der Actinmix und der neue C/eBP Mix verwendet, da man bei der letzten PCR nicht genau sagen konnte ob der neue C/eBP Mix auch wirklich funtioniert hatte.
Als Gewebeproben wurde Gewebe von der Lunge, dem Bauch, dem Thymus, der Haut, dem Muskel, dem Knochenmark und der Speichekdrüse verwendet. Morgen werde ich herausfinden ob dies funktioniert hat.

Heute habe ich die Konzentration von der DNA DRE ERT gemessen, die ich am Mittwoch in einer Bakterienkultur hab wachsen lassen, nachdem ich eine MINI Isolation durchgeführt hatte. Sie war sehr hoch.

Dann habe ich eine MINIisolation mit der DNA 2-4 A und 2-4 B gemacht. Auch diese Konzentration war sehr hoch.

Dann habe ich eine RT- PCR gemacht. Wieder habe ich die Mastermixes Actinmix und C/eBP verwendet, doch diesmal hatte ich ein neues C/eBP weil das alte, wie man bei der vorigen PCR gemerkt hatte womöglich veraltet war und deswegen nicht so gut funktioniert hatte.
Wieder war das Ergebnis unklar. Der Actinmix hatte wieder einwandfrei funktioniert, bei dem C/eBP kann man es nicht so gut sagen.

Heute habe ich eine MIDI Isolation der DNA 2-4 und 3-4 gemacht. Leider war die Konzentration sehr niedrig.

Dann habe ich eine RT- PCR gemacht, wieder mit den Mastermixes Actinmix und C/eBP. Diesmal mit 4 anderen DNAs. Auch hier wurde bewiesen, dass der Actinmix um einiges besser abgeschnitten hatte, als der C/eBP Mix.

Dann habe ich meine erste Ligation (Beschreibung in Methoden und Experimenten unter meinem Blog) durchgeführt. Es war eine Ligation von der DNA DRE in das UBI- myc Plasmid. Wie sich herausstellte hatte sie sehr gut funktioniert.

Dann habe ich noch eine Bakterienkultur angelegt. Und zwar in 18 Eppis die DNA DRE ERT. Diese würde über die Nacht bei 37 Grad Celsius wachsen.

Heute habe ich 4 Verdaue hergestellt für den anschließenden Restriktionsverdau, den ich mit den DNA Klonen (V+F) Nr 15 und Nr 17 durchführen werde, um herauszufinden ob diese (V+F) die richtigen Klone sind.
Dazu habe ich 4 Lösungen produziert, die für 2h in den Inkubator bei 37 Grad Celsius kamen. Um diese dann zu vergleichen habe ich eine Gelelektrophorese durchgeführt. Diese hat gezeigt, dass V+F nicht die richtigen Klone waren.

Dann habe ich eine Genexpression von C/eBP also eine PCR gemacht.
Meine zwei Mastermixes waren C/eBP Mix und Actinmix. Die DNA, die ich verwendet habe war Spleen und Liver.
Dabei habe ich herausgefunden, dass der Actinmix, wie immer sehr gut funktioniert hat, aber der C/eBP Mix nicht.

Heute habe ich eine Wiederholung der Gelelektrophorese von D2, C6 und P5 gemacht, da die letzte nicht wirklich gut funktioniert hat. Ich habe wieder 3 Lösungen hergestellt:

1. Lösung D2: 5 Mikroliter 10 mal fast digest Puffer
3 Mikroliter ECO R1
42 Mikroliter D2

2. Lösung C6: 5 Mikroliter 10 mal fast digest Puffer
3 Mikroliter ECO R1
42 Mikroliter C6

3. Lösung P5: 5 Mikroliter 10 mal fast digest Puffer
3 Mikroliter ECO R1
42 Mikroliter P5

Diese kamen in den Inkubator bei 37 Grad Celsius für ca 2 h. Dann habe ich die Gelelektrophorese gemacht.
Doch auch diesmal war die Konzentration nicht sehr hoch.


Danach habe ich eine PCR mit D2, C6 und P5 durchgeführt. Dies hat leider garnichts gebracht, denn als ich dann die Gelelektrophorese durchgeführt hatte, war die Konzentration so gut wie nicht vorhanden.

Schließlich habe ich noch eine MINI Isolation von der DNA V+F gemacht. 18 Klone habe ich von der Ampicilinplatte gepickt und danach die MINI Präperation durchgeführt. Als ich die 18 DNA Klone isoliert hatte, habe ich noch eine Gelelektrophorese gemacht um die 18 Klone zu vergleichen. Das Ergebnis war, dass die Klone Nr 15 und Nr 17 am meisten DNA konzentriert waren. Also habe ich die Konzentration dieser beiden gemessen. Mir ist dabei eine sehr hohe Konzentration herausgekommen, worüber ich sehr froh war.

Am Donnerstag habe ich wieder eine PCR durchgeführt mit 2 Mastermixes und den DNAs D2, C6 und P5. Nach der PCR habe ich dann noch ein Foto mit der Gelelektrophorese gemacht um sie zu vergleichen. Doch das Ergebnis war eher nicht so gut. Es hab so gut wie keine DNA Konzentration.

Danach habe ich meine erste RT- PCR gemacht (Beschreibung in Methoden/Experimente)
Diese ist sehr gut verlaufen. Ich hatte diesmal 3 Mastermixes ( Actinmix, Ship1 Mix, FAS Mix). Am besten ist der Actinmix ausgefallen. Ich habe herausgefunden, dass dies ein guter Primer ist.
Um das zu bestätigen habe ich gleich noch eine RT- PCR durchgeführt. Mastermixes waren Actinmix, LIF Mix und HIF2 Mix. Wieder hat der Actinmix am besten abgeschlossen.

Auch am Freitag habe ich diese Methode angewendet um ganz sicher zu gehen. Auch diesmal war unter den Mastermixes Actinmix, P53 Mix und Ship Mix der Actinmix am besten.

Bei der Messung der DNA Konzentration von D2, C6 und P5 kamen mir leider nur sehr niedrige Werte heraus. Auch nachdem ich eine PCR mit verschiedenen Mastermixes und diesen DNAs versucht hatte war das Ergebnis nicht gut.

Heute habe ich das Genotypisieren kennengelernt. So findet man heraus welcher Genotyp der richtige ist. Dazu haben wir Proben von 7 verschiedenen Mäusen genommen und diese in 2mL Genomic DNA Lysis Puffer und 10 Mikroliter Proteinase K eingelegt. Das kam dann in den Thermomixer.

Dann habe ich eine PCR durchgeführt, die leider nicht so gut gelaufen ist wie ich es mir vorgestellt hatte.

Außerdem war ich im Maushaus. (mehr dazu auf meinem Blog unter Persönliches/Eindrücke)

Nachdem ich eine Bakterienkultur über die Nacht angelegt hatte, nahm ich diese am nächsten Tag aus dem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Ich isolierte die DNA und machte eine DNA- Messung mit dem Nanodropreader. Da mir hohe Werte herauskamen, wusste ich, dass es diesmal gut gelaufen ist.

Dann musste ich eine Sequenzierung durchführen. Ich musste dazu 3 verschiedene Lösungen vorbereiten.

1. Lösung:
1 Mikroliter von der isolierten DNA 20
9 Mikroliter H2O
2 Mikroliter LD (Loading Dye)

2. Lösung:
1 Mikroliter DNA MIR 223
9 Mikroliter H2O
2 Mikroliter LD

3. Lösung
1 Mikroliter DNA MIR 361
9 Mikroliter H2O
2 Mikroliter LD

Diese 3 Lösungen gab ich in ein Agarosegel für die Elektrophorese und verglich sie. Dann schickte ich das Bild was ich dadaurch bekommen hatte samt der DNA Lösungen zur Sequenzierung. Dadurch können wir die Orientierung der DNA herausfinden und ob beim Klonieren der DNA der Vektor 100% passt.

Zum Schluss habe ich noch einen Retriktionsverdau hergestellt. 4 Lösungen habe ich produziert. Die ersten 2 mit der DNA 20 und die anderen 2 mit zwei unbekannten DNAs. Diese habe ich in den Inkubator bei 37 Grad Celsius für 2h ruhen lassen. Dann wurde noch eine Gelektrophorese durchgeführt um die Lösungen miteinander zu vergleichen.

Heute habe ich eine DNA Isolierung aus Bakterien (MINI) durchgeführt. (Beschreibung in meinem Blog unter Experimente)
Nachdem ich die Konzentration der DNA gemessen hatte bekam ich ein zufriedenstellendes Ergebnis. Die Konzentration lag bei 97,3 ng/Mikroliter.

Danach habe ich wieder eine DNA Isolierung aus Bakterien gemacht nur diesmal in größerem Format also MIDI.
Leider lag die DNA Konzentration sehr niedrig. 18,2 ng/Mikroliter. Ein eher schlechtes Ergebnis.

Zum Schluss habe ich noch für den nächsten Tag eine Bakterienkultur angelegt. Also zwei verschiedene DNAs in 2 Kolben mit LB Ampicilin gegeben und über die Nacht in einen Ikubator bei 37 Grad Celsius ruhen lassen.

Die letzten zwei Tage habe ich viel neues gelernt und gelerntes anwenden müssen. Am Dienstag haben wir mit einer PCR also eine Polymerase Chain Reaction angefangen. Mithilfe dieser Methode kann auch eine ganz kleine Menge an DNA vervielfältigt werden.

Dann musste ich einen Lysis Puffer herstellen um genomische DNA (in meinem Fall war es ein Stück von einem Mausschwanz) zu isolieren.
Erst am nächsten Tag, also Mittwoch, konnte ich die Isolierung der DNA durchführen, da die genomische DNA über die Nacht im Lysis Puffer in einem Inkubator bei 55 Grad Celsius ruhen musste.

Außerdem habe ich eine Plasmid DNA Isolierung aus Bakterien durchgeführt. Da die DNA in den Bakterien enthalten ist muss man einige Schritte durchführen um zum gewünschten Ergebnis ( also eine isolierte Plasmid DNA) zu kommen. Zum Schluss wird die Konzentration der DNA gemessen mit dem Nanodropreader.

Danach habe ich gelernt wie man einen Restriktionsverdau durchführt. Diese Methode wird angewandt um eine spezifische DNA Sequenz zu schneiden. Die Restriktionsenzyme erkennen die Nukletide und trennen sie an dieser Stelle.