Probleme / Aufgaben
10:28 / 26.06.2009
Hier findest du Platz für deine Forschungsdokumentation.
Forschungsdokumentation
Freitag, 26. Juni 2009
Persönliches / Eindrücke
10:28 / 26.06.2009
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Methoden / Experimente
10:28 / 26.06.2009
Liquor Aufbereitung:
-Liquor in 15 ml Tubes füllen
-5 min bei 5000 rpm (rotations per minute) und 4°C zentrifugieren;
dabei austarieren nicht vergessen
-den entstehenden Überstand auf 2 ml Reaktionsgefäße ("Eppis") verteilen
-das Pellet verwerfen, denn es ist für die folgenden Experimente wertlos
-die 2 ml Eppis 20 min bei 13.000 rpm und 4°C zentrifugieren
-den Überstand mit Nadel und Spritze aufsaugen
-die Nadel verwerfen
-800 mikroliter des Liquors je Eppi mit der Spritze durch eine Membran drücken
-pro Eppi 1mikroliter Proteaseinhibitor hinzufügen; dieser soll die Tätigkeit von Proteasen (Enzymen, die Proteine zersetzen) unterdrücken
-der so aufbereitete Liquor kann für spätere Untersuchungen bei bis zu -80 °C aufbewahrt werden
10% DMEM:
-man bereite 500 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium; benannt nach Renato Dulbecco und Harry Eagle; zur genauen Zusammensetzung siehe Wikipedia), 5,5 ml FCS (fetales Kälberserum; aus dem Blut von Kuhfeten gewonnen und wichtiger Bestandteil von Nährmedien aufgrund seines Gehaltes an Wachstumfaktoren), 5,5 ml MEM non essential amino acids (Medium mit nicht essentiellen Aminosäuren) und 5,5 ml Gentamicin (Antibiotikum; soll Bakterien abtöten) vor
-man mischt die oben genannten Bestandteile in einer Flasche
-das Gemisch wird nun in eine sterile Flasche filtriert
-fertig ist das 10% DMEM (die 10% beziehen sich auf den Gehalt an FCS)
Mediumwechsel:
-zuerst muss das Medium aus der Kulturflasche abgesaugt werden
-nun wird die Flasche mit ca. 10 ml PBS (Phosphate Buffered Saline; Puffer zur Reinigung) gefüllt
-der Puffer wird in der Flasche geschwenkt und schließlich abgesaugt; so soll die Flasche von den letzten Mediumresten befreit werden
-nun werden 10 ml 10% DMEM oder SFM in die Flasche gefüllt und die Kultur zum Wachsen in den Brutschrank gestellt
-Liquor in 15 ml Tubes füllen
-5 min bei 5000 rpm (rotations per minute) und 4°C zentrifugieren;
dabei austarieren nicht vergessen
-den entstehenden Überstand auf 2 ml Reaktionsgefäße ("Eppis") verteilen
-das Pellet verwerfen, denn es ist für die folgenden Experimente wertlos
-die 2 ml Eppis 20 min bei 13.000 rpm und 4°C zentrifugieren
-den Überstand mit Nadel und Spritze aufsaugen
-die Nadel verwerfen
-800 mikroliter des Liquors je Eppi mit der Spritze durch eine Membran drücken
-pro Eppi 1mikroliter Proteaseinhibitor hinzufügen; dieser soll die Tätigkeit von Proteasen (Enzymen, die Proteine zersetzen) unterdrücken
-der so aufbereitete Liquor kann für spätere Untersuchungen bei bis zu -80 °C aufbewahrt werden
10% DMEM:
-man bereite 500 ml DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium; benannt nach Renato Dulbecco und Harry Eagle; zur genauen Zusammensetzung siehe Wikipedia), 5,5 ml FCS (fetales Kälberserum; aus dem Blut von Kuhfeten gewonnen und wichtiger Bestandteil von Nährmedien aufgrund seines Gehaltes an Wachstumfaktoren), 5,5 ml MEM non essential amino acids (Medium mit nicht essentiellen Aminosäuren) und 5,5 ml Gentamicin (Antibiotikum; soll Bakterien abtöten) vor
-man mischt die oben genannten Bestandteile in einer Flasche
-das Gemisch wird nun in eine sterile Flasche filtriert
-fertig ist das 10% DMEM (die 10% beziehen sich auf den Gehalt an FCS)
Mediumwechsel:
-zuerst muss das Medium aus der Kulturflasche abgesaugt werden
-nun wird die Flasche mit ca. 10 ml PBS (Phosphate Buffered Saline; Puffer zur Reinigung) gefüllt
-der Puffer wird in der Flasche geschwenkt und schließlich abgesaugt; so soll die Flasche von den letzten Mediumresten befreit werden
-nun werden 10 ml 10% DMEM oder SFM in die Flasche gefüllt und die Kultur zum Wachsen in den Brutschrank gestellt
