Das wars dann wohl mit dem Spaß im Labor, und ich schreibe den letzten Eintrag. Irgendwie war die Stimmung leicht getrübt und wie es eben so ist, wenn etwas vorbei ist, das Spaß gemacht hat, fiel mir der Abschied schwer. Der letzte Western Blot Test wurde noch entwickelt und nach einem abschließenden, gemütlichen Beisammensein im Sozialraum wurde ich heute früher als sonst entlassen. Ich bin sehr froh in diesem Labor und der fast familiären Athmosphäre Erfahrungen gesammelt haben zu dürfen, und kann auf wunderbare, lehrreiche und lustige 3 Wochen zurückblicken. An dieser Stelle ein herzliches Dankeschön an alle (an erster Stelle meinem Betreuer), die mir diese Zeit so angenehm gestaltet haben.

Das Praktikum neigt sich langsam dem Ende zu, und ich kann ehrlich sagen, dass ich das Labor (und alle dort Arbeitenden) jetzt schon vermisse. Ich hatte heute die Möglichkeit mich weiter an mehr Selbstständigkeit beim Western Blot Test zu üben, und habe dabei noch einmal fest gestellt, dass diese Arbeitsschritte umfangreicher als beim Elisa sind und ich aufpassen muss, dass ich nichts verwechsle. Trotzdem – das Pipettieren der Proteinleiter und der Proben fiel mir heute schon leichter.

Zu meinen Freuden durfte ich auch wieder Gewebe vorbereiten. Dabei habe ich bemerkt dass ich – verglichen mit meinen ersten Versuchen – bereits geschickter und schneller arbeiten kann. Freude macht es mir noch immer wie beim ersten Versuch. Möglicherweise geht es sich am letzten Tag ja noch aus, die Gewebeteilchen in Wachs einzulegen, zumal der Western Blot Morgen nur noch nach wenigen Schritten verlangt.

Ich kann kaum glauben, dass heute schon der vorletzte Tag sein soll – die Zeit ist so schnell verflogen, was für mich nur noch mehr der Beweis ist, wie gut mir die Arbeit gefällt.

Heute begann der Tag mit der Präparation des zweiten Antikörpers. Hierzu mussten die Membranen mit Milchbuffer auf der Wippe gewaschen werden. Der zweite Antikörper wirkt dann (vermischt mit Milchbuffer) 40 Minuten lang ein. Auch nach dem zweiten Antikörper erfolgt ein Waschgang. Dann erfolgt das Entwickeln und Färben.

Solution A und Solution Be (40:1) wird immer wieder über die Membran pipettiert, danach wird die Membran in Frischhaltefolie verpackt, abgetupft und in die Filmkasette geklebt. In der Dunkelkammer wird der Film aufgelegt, welcher zwischen einem Zeitraum von 5 - 60 Minuten entwickelt sein kann. Zuletzt wurden noch die Standards eingezeichnet, und mein erster Western Blot war fertig . Insgesamt ist der Western Blot Test aufwendiger als der Elisa Test und es würde noch einiger Durchgänge bedürfen, bis ich wirklich alle Schritte selbstständig durchführen könnte, aber ich befürchte dafür wird die Zeit leider nicht reichen. Ich bin dennoch dankbar auch diese Testform kennen gelernt zu haben.

Das Gel der Western Blot Reihe wurde über Nacht hart und musste nun „geladen“ werden. Hierbei muss immer eine Kontrolle mit laufen, rechts und links wird die Proteinleiter pipettiert. Je nach Protein wird eine andere Verdünnung gewählt, das Plasma oder Serum wird mit Aqua dest. und Lämmli sampler buffer verdünnt. Im Thermomixer werden die Proteine denaturiert, die Eppis müssen hierfür vorher mit einer Nadel aufgestochen werden (Hitze).

Als nächsten Schritt werden die Gele in die Kammer gegeben, der Raum zwischen den Gelen wird mit SDS running buffer aufgefüllt und die Proben in die Geltaschen pipettiert. Die Proteinleiter befindet sich an erster und letzter Stelle, die Proben sollten von unten nach oben pipettiert werden (um ein verrinnen zu vermeiden). Für diese Pipettierarbeit muss eine Spritze verwendet werden, da eine Pipette zu groß wäre. Zwischen den Proben muss die Spritze deshalb immer wieder mit Aqua dest. gespült werden, da hier nicht nach jeder Benutzung die Spitze gewechselt werden kann.

Die in der Kammer befindlichen Gele werden dann unter Strom gesetzt – auch hier kommt es wieder auf die Art des Proteins an, wie hoch und wie lange dieser Schritt durchgeführt wird.

Haben die Proben das Gel durchlaufen, wird das Gel von der Glasplatte gehoben und zwischen Sw Spange, Vlies und Filterpapier gesandwiched. Die Platten werden wieder unter Strom gesetzt (diesmal mit Eis um Überhitzen zu vermeiden). Nun wird die Membran kleiner geschnitten und markiert. Nach der Präparation mit dem ersten Antikörper (in unserem Fall Anti Dcx) wartet die Membran wieder über Nacht. Morgen wird dann noch der zweite Antikörper (hier HRP conjugated anti goat) zugefügt und das ganze entwickelt. Noch kann ich mir diesen letzten Schritt nicht gut vorstellen, ich bin schon sehr gespannt, wie dies von statten geht.

Der heutige Tag begann bereits mit den Vorbereitungen für den Western Blot Test. Hierfür mussten die verschiedenen Reagenzien bereitgestellt werden, der Vormittag verflog also mit einwiegen, vermengen und rühren. Obwohl ich immer ein bisschen Angst hab mich zu verlesen oder etwas falsch zu interpretieren genoss ich diesen Vormittag, ich kam mir vor wie eine Alchemistin ^^.

Sind alle Reagenzien bereit gestellt, so beginnt man (nach dem Zusammenbauen der Teile) mit dem Gel. Hier ist rasches Arbeiten angesagt, da das Gel sonst frühzeitig aushärtet. Bis das erste Gel hart wird verhindert eine dünne Aqua dest. Schicht das Austrocknen der Substanz. Ist das zweite Gel zwischen die Glasscheiben gegossen wartet das Ganze im Kühlschrank in einem mit befeuchteten Papier gefüllten Kunststoffsäckchen (wieder um Austrocknen zu verhindern) bis zum nächsten Tag.

Inzwischen wurde mir noch wertvolles theoretisches Wissen über die Literaturrecherche im Internet beigebracht. Nebenbei durfte ich mir hier Artikel aussuchen, die Fragen zu den verschiedenen Testreihen (erweitert) beantworten.

Die Western Blot Reihe verspricht mindestens so interessant zu werden wie die Elisa Tests, ich bin schon gespannt, wie es Morgen weitergeht. Wie auch beim Elisa, ist mir die Anleitung alleine noch zu wenig, durch das praktische Arbeiten wird nach und nach Klarheit geschaffen.

Die zweite Woche ist um und ich kann kaum glauben, wie schnell die Zeit verflogen ist. Heute wurde die CD-3 Partie fertig gestellt, alle Objekte konnten erstmals unter dem Mikroskop begutachtet werden.

Ein Teil wurde heute noch gefärbt: Bielschowsky Färbung. Auch hier werden die Objekte zuerst entparaffiniert. Sehr interessant fand ich die Silbernitrat-Ammoniak Lösung. In einen Kolben wird Silbernitrat gefüllt und tropfenweise unter Rühren Ammoniak zugegeben, bis die Flüssigkeit wieder klar wird. Dieser Vorgang dauert vor allem dann ziemlich lange wenn man noch nicht weiß, wie viel Ammoniak benötigt wird. Zusätzlich irritiert die Flüssigkeit mit ihrem immer dunkler werdenden braun, bis sie nach fast schwarzer Farbe wieder klar wird. Bei dieser Färbung werden die Axone schwarz und der Hintergrund gelbbraun, was unter dem Mikroskop sehr genau zu erkennen ist (und wirklich gut aussieht).

Das gestern geschnittene Gewebe musste wieder in Wachs eingelegt werden. Ich hatte ja beim ersten Versuch dieses Arbeitsschrittes mit dem Rückenmark zu kämpfen. Nun, ich habe seit heute einen neuen Feind: Optische Nerven. Das Bild unter der Kategorie "Histo" sollte dabei selbsterklärend sein....

Nächste Woche werde ich sicher noch einmal meine "Werke" unter dem Mikroskop betrachten. Dann wird mit Western-Blot gestartet :-)