Das Gel der Western Blot Reihe wurde über Nacht hart und musste nun „geladen“ werden. Hierbei muss immer eine Kontrolle mit laufen, rechts und links wird die Proteinleiter pipettiert. Je nach Protein wird eine andere Verdünnung gewählt, das Plasma oder Serum wird mit Aqua dest. und Lämmli sampler buffer verdünnt. Im Thermomixer werden die Proteine denaturiert, die Eppis müssen hierfür vorher mit einer Nadel aufgestochen werden (Hitze).

Als nächsten Schritt werden die Gele in die Kammer gegeben, der Raum zwischen den Gelen wird mit SDS running buffer aufgefüllt und die Proben in die Geltaschen pipettiert. Die Proteinleiter befindet sich an erster und letzter Stelle, die Proben sollten von unten nach oben pipettiert werden (um ein verrinnen zu vermeiden). Für diese Pipettierarbeit muss eine Spritze verwendet werden, da eine Pipette zu groß wäre. Zwischen den Proben muss die Spritze deshalb immer wieder mit Aqua dest. gespült werden, da hier nicht nach jeder Benutzung die Spitze gewechselt werden kann.

Die in der Kammer befindlichen Gele werden dann unter Strom gesetzt – auch hier kommt es wieder auf die Art des Proteins an, wie hoch und wie lange dieser Schritt durchgeführt wird.

Haben die Proben das Gel durchlaufen, wird das Gel von der Glasplatte gehoben und zwischen Sw Spange, Vlies und Filterpapier gesandwiched. Die Platten werden wieder unter Strom gesetzt (diesmal mit Eis um Überhitzen zu vermeiden). Nun wird die Membran kleiner geschnitten und markiert. Nach der Präparation mit dem ersten Antikörper (in unserem Fall Anti Dcx) wartet die Membran wieder über Nacht. Morgen wird dann noch der zweite Antikörper (hier HRP conjugated anti goat) zugefügt und das ganze entwickelt. Noch kann ich mir diesen letzten Schritt nicht gut vorstellen, ich bin schon sehr gespannt, wie dies von statten geht.