gestern habe ich noch für einen weiteren E. coli Stamm Primer designt um Gapfilling zu betreiben. 8 sets haben ich und mein betreuer letztendlich kurz vor 6 noch fertig gestellt.

der heutige tag war geprägt vom warten auf die ankunft der am dienstag bestellten primer (und einer coolen willkomensfeier der sekretärin ;)

ich hab den ganzen tag an meinem protokoll für meinen betreuer gearbeitet (aber nur für den BL21 stamm mit dem ich ursprünglich betraut war) und es gerade fertig gestellt und die letzten korrekturen gemacht, als die primer endlich gekommen sind.

gerade vorhin haben wir sie noch schnell aufgenommen. das pipetierschema hab ich schon fertig, morgen in der früg gehts gleich ab ins labor!! *freu*

freitag nachmittags erhielt ich von meinem betreuer eine einweisung in das projekt meiner arbeitskollegin (eine andere praktikantin, die von FIT hierher gekommen war).
es geht dabei um den vergleich einander verwandter bzw voneinader abgeleitete E. coli-stämme. mache waren bereist voll sequenziert wie der an dem ich zuvor gearbeitet hatte, andere teilweise bekannt und wieder andere wurden aus dem abgleich von bereits sequenzierten verwandten stämmen und bereits erhaltenen eigenen sequezierdaten zusammengesetzt.

meine erste aufgabe war es primer zu designen um festzustellen wie sich in einem bestimmten stamm (an dessen "zusammenbau" des genoms meine arbeitskollegin bereits länger arbeitete) größere abschnitte der DNA tatsächlich angeordnet hatten (zwischen den stämmen gibt es durch drehungen von fragmenten und anderen faktoren immer wieder unterschiede, wo sich bestimmte abschnitte im gesamtgenom befinden).
ich arbeitete also im bereits sequenzierten genom eines vergleichsstammes um die primer zu designen und musste die erhaltenen dann sowohl gegen die datenbank des bereits komplett bekannten stammes als auch gegen die beiden vermuteten variatonen unseres zu untersuchenden stammes blasten und danach meine primer auswählen.

währenddessen arbeitete meine kollegin mit hilfe neuer vergleichsdaten weiter und kam ganz ohne labor mit einem computerprogramm zum gewünschten ergebnis (in welcher abfolge sich die fragmente mit höchster wahrscheinlichkeit befinden).

somit wurden die primer nicht mehr gebraucht und ich bekam eine neue aufgabe: in einem anderen zu untersuchenden stamm (dessen untersuchung bereits wesentlich weiter fortgeschritten war), gab es zwischen vielen bekannten abschnitten immer noch einige löcher völlig ohne information. dafür sollte ich primer designen, um durch laborergebnisse an unsere benötigten sequenzierinformationen zu kommen.

ich sollte 6 stellen untersuchen, wobei 4 zwischen 400 und 600 bp lang waren. um die eindeutigkeit unserer sequenzierergebnisse zu gewährleisten und zuordnen der stelle im genom zu ermöglichen, musste ich um die gesuchten stellen enstprechend noch platz lassen, was die fragmente dementsprechend verlängert. smit entsprachen sie zwar nicht mehr den optimalbedingungen (die ich bei meinen allerersten primersätzen angestrebt habe, da da nur einzelne unstimmigkeiten in der sequenz aufzulösen waren), aber die technik der sequenzierfirma hat sich auch bei fragmenten dieser länge durchaus als gut erwiesen und die angestrebte qualität ist trotzdem gewährleistet. bei den anderen beiden stellen wird es etwas schwieriger: das eine hat 750bp und mit dem sicherheitsabstand werde ich ein fragment der länge von 900bp erhalten. dadurch überlappen sich die ergbenisse des forward und reward primers nicht mehr, wir sollten aber trotz allem ein schönes ergebnis bekommen.
der letzte kandidat ist mit wesentlich mehr arbeit verbunden. die zu füllende lücke ist mehr als 4500bp lang. ich habe ein erstes primerset dafür designt. mit den ergebnissen unserer 1. pcr werden wir auf beiden seiten randstellen von 500 bis 700bp sequenzieren können. in diese neu festgestellten regionen werde wieder primer designt, die das loch um weitere 1000 verkürzen sollten. so arbeitet man sich nach immer weiter innen, bis sich die primer überlappen oder davor unbestimmte fragmente der region zuordnen lassen und noch mehr daten liefern.

dienstag nachmittag stellte ich die 6 primersets fertig und mein betreuer designte selbst noch ein paar weitere für ein anderes projekt um dien bestellumfang zu erhöhen. die bestellung der primer ging noch am selben tag raus und sie sollten morgen da sein. wenn bis dahin auch noch die benötigte dna der unterschiedlichen stämme angekommen ist, kann ich wieder im labor arbeiten.

PS: der stamm unserer vergleichsstudie, die wir korrigieren wollten ist scheinbar momentan nicht verfügbar, denn er ist eingegangen. vll findet der betreuer der stämme in wien noch ein paar tiefgekühlte proben der dna, sonst können wir nur die dna unseres eigenen stammes noch einmal untersuchen. weiteres wird sich weisen...

am donnerstag bekamen wir noch die ersten sequenzierergebnisse. wir betrachteten die qualität der ergebisse auf der GLC Genomics Workbench und waren erfreut festzustellen, dass alle proben von ausgezeichneter qualität waren. dann ging ich daran die bekommenen sequenzen gegen die datenbank der werte unserer vergleichstudie zu blasten, um zu überprüfen ob deren sequenz unseren ergebnissen entspricht oder es unterschiede gibt. gleichzeitig glich ich unsere neuen sequenzierergebnisse mit unserer eigenen datenbank ab, um festzustellen ob die zu korrigierenden unstimmigkeiten auch dem erwarteten entsprechen. es erwies sich unsere vergleichssudie immer als korrekt und mein betreuer machte sich daran die neuen daten in unsere datenbank des genoms zu integrieren.

mein nächster auftrag war zu 2 stellen, bei denen wir vermuteten unsere vergleichsstudie korrigieren zu müssen (da wir bereits eindeutige ergebnisse zu diesen stellen unseres stammes haben), primersets zu designen. also wieder das selbe prozedere von stellen heraussuchen, eindeutigkeit der umgebung feststellen, in ein neues file kopieren, die stellen blasten, geeignete primerstellen herausfinden, die primer designen, passende sets heraussuchen, wieder in ein neues file und blasten, ungeeignete primer ausschließen, primersequenz verlängern und die temperatur optimieren. danach die besten sets auswählen, nocheinmal ein kontrollblast bezgl lage und richtung und erneutes einfügen in dem temperaturkalkulator um fehler auszuschließen. freitag morgen hatte ich meine 2 finalen primersets fertig.

danach wertete ich unsere weiteren sequenzierergebnisse aus. erfreulicherweise war die qualität wieder sehr gut. wieder erwies sich unsere vergleichsstudie als korrekt und wir korrigierten unsere datenbank.

warum ich die beiden letzten primersets noch gemacht habe: wir wollten sie sowohl auf der DNA von unserem stamm als auch von dem originalstamm unserer vergleichsstudie anwenden, und so überprüfen ob in unserem stamm eine punktmutation stattgefunden hatt, oder die vergleichsstudie einen fehler hat, der zu korrigieren ist....aufgrund unserer bereits verabreiteten daten, erwarten wir nicht unsere sequenz korrigieren zu müssen, da die daten doch sehr eindeutige ergebnisse lieferten.

diese methode habe ich bei meinen letzten 7 abschnitten angewendet. da die umgebung zu uneindeutig war, musste ich die länge der stücke auf 2000 Basenpaare bis 4000Bp erweitern. solche stücke sind aber nicht sequenzierbar und deshalb setze ich nicht nur außen primer, sondern auch innen, wodurch ich dann wieder ein 400-500 Bp langes fragment erhalte.

dementsprechend musste ich für die nested pcr je 2 primersets designen und zuerst eine pcr für die äußeren, dann für die inneren primer ansetzen.

dienstags machten wir die pcr für die äußeren primer. zuerst mussten wir noch die konzentrationsmessung und anpassung eines vergleichsprimersets aus wien (das eine länge von 200Bp ergab) machen. wir erstellten einen mastermix inklusive dna der konzentration 20ng/µl und pipettierten davon 40µl in jeden pcr-tube und fügten die outer primer hinzu. aufgrund der unterschiedlichen basenlänge der proben benutzen wir 2 blöcke der pcr. einen für die fragmente der länge knapp über 2000 und einen für die um 4000Bp länge. die probe #18 setzte ich doppelt an, da diese stelle so kompliziert war, dass ich 2 inner primer sets benötigte um die zu sequenzierenden stellen in schöne stücke zu bekommen.

nach der pcr wurden wieder rund 30µl des pcr produktes mit dem clean-up kit aufgereinigt und die konzentrationen gemessen.

mittwoch morgen passte ich die konzentrationen der aufgereinigten pcr-produkte auf 2ng/µl an und mischte einen neuen mastermix an. diesmal kamen aber 5µl H2O mehr dazu, da ich vom verdünnten pcr-produkt nur 5 µl benötigte. das piepttieren der neuen pcr ansätze war sehr viel arbeit, da in jedes pcr-gefäß nicht nur die 2 inner primer, sondern auch die DNA (also das aufgereinigte verdünnte PCR-Produkt) exta hineinkam und jedes mal spitzen wechseln nötig war....

während die pcr fertig wurde, bereitete ich bereits den clean-up kit vor und mein betreuer das gel. danach fanden aufreinigen und längenkontrolle durch die elektrophorese paralell statt und nach dem mittagessen werteten wir die ergebnisse aus. das ist das ergebnis der längenkontrolle durch die gel-elektrophorese:

zuerst ist der referenzprimer und die 2000er stücke augetragen, darauf folgen die beiden 18er und die restlichten 4000er fragmente. dann kommt eine vergleichleiter für fragmente mit wenigen tausend Basenpaaren.der 2. abschnitt besteht aus den ergebnissen der 2. PCR (mit den inner primern) in aufsteigender zahlenreihenfolge (beginn mit einem referenzprimer, 18 wieder doppelt) und wir beendet von einer 100er leiter.

nach dem abgleich der ergebnisse der gelelektrophorese mit unseren berechneten längenangaben ginge wir wieder in labor und passten nach unseren messungen die konzenrationen des aufgereiningten pcr-endprodukte an.

zu 10µl pcr-produkt der konzentration 10ng/µl gaben wir 4µl der auf 5pmol/µl verdünnten primer (einmal forward, einmal reverse) und schickten diese mischung an die sequenzierfirma.

dienstag morgen bin ich gleich ins labor und hab mtihilfe einer kollegin die richtigen primer aufgenommen. da im schüttler weniger platz hatten als ich aufnehmen wollte, habe ich zuerst die äußeren primer und dann erst die inneren mit wasser versetzt.während die erste partie noch fertig geschüttelt wurde, habe ich in die gefäße vom letzten mal wieder eine verdünnung von 40 und dann 20ng/µl hergestellt.

mal abgesehen davon, dass ich bereits einmal einen fehler gemacht hatte und am vortag statt die 40er lösung eins zu eins zu verdünnen pure dna nahm, habe ich meine epis mit 400, 200 und 100 ng beschriftet. (ich wusste schon, dass diese werte nur für 10µl galten, aber ich ging bei der beschriftung von der zielmenge an dna im pcr ansatz aus) das führte zu verwirrung und der irrigen annahme ich hätte viel zu niedrige verdünnungen hergestellt, die unbrauchbar wären. nach einigen messungen warfen wir sie in das mistsackerl am tisch. während ich alle primer auf die gewünschte verdünnung von 5pmol/µl brachte, ging mir aber immer noch nicht ein wo mein fehler war, dass ich so (vermeintlich) falsche verdünnungen hergestellt hatte.
endlich kam mir die erkenntnis, dass meine irreführenden beschriftungen der grund für das maleur waren, aber die konzentrationen perfekt waren. ich holte also die epis wieder aus dem mistsackerl raus und beschriftete sie richtig.

was ich dadurch gelernt habe: immer eindeutige beschriftungen wälen die nicht zu verwechslungen oder missverständnissen führen....und auch in einigen monaten noch sinnvoll verstanden werden, wenn ich nicht mehr genau im kopf habe, was ich damit gemeint habe.

wie ich bereits berichtet habe, habe ich am freitag mein pipetttierschema für die dna-verdünnungen und den pcr-mix entwickelt.

montag morgen begann ich damit die bereits aufgenommenen primer auf die gewünschte konzentration von 5pmol/µl zu bringen. nach dem erneuten messen der dna, stellte ich auch die benötigten mengen an verdünnungen für die pcr-ansätze her.

wir wollten 2 pcr's machen: als erstes einen testlauf der verschiedenen dna-konzentrationen mit 17 und 19 (die beiden stellen, die wir mit inner primern zum sequenzieren einschicken wollten. das bedeutet statt dem bei der pcr verwendeten primer wird bei der probe, die zu sequenzieren eingeschickt wird, ein anderer primer - also der "inner" mitgeschickt, der das zu sequenzierende stück auf die gewünschten etwa 400 Basenpaare bringt)
die 2. pcr enthielt alle 5 kurzen stücke + einen reverenzprimer aus wien, die verwendete dna-konzentration betrug 20 ng/µl.

der mastermix für den ersten ansatz enthielt keine dna, ich habe die bestandteile in folgender reihenfolge und menge hinzugefügt: 170µl hochrein destilliertes H2O, 100 µl GC-Buffer, 15µl DMSO, 10µldNTP (dieses vorgemisch wurde kräftig gevortext und danach wieder zentrifugiert) und 5µl Polymerase(die wird mit einem teifkühlhalter, der sie auf -20°C hält, transportiert und schnellst möglich wieder zurück gebracht)
sobald die polymerase hinzugefügt wurde, muss schnell gearbeitet werden.
30µl des mastermix wird in pcr-behälter gegeben, dazu 10µl der DNA-Verdünnung und je 5µl der primer.

Die pcr-tubes werden in einen der 4 blöcke des thermocyclers gestellt und das bereits vorher eingestellte temperaturprofil aktiviert. dann heißt es warten: meist 1 bis 2.5 stunden.....

am montag haben wir aber gleich weiter gearbeitet und die pcr für die kurzen fragmente vorbereitet. was heißt wieder mastermix erstellen. aber diesmal haben wir die DNA in einer konzentration von 20ng/µl noch vor der polymerase noch. hätte diese konzentration nicht gut funktioniert (was wir beim ergebniss der gelelektrophorese gesehen hätten), hätten wir später noch eine mit 40ng oder 10 ng versucht.

zusätzlich zu den 5 kurzen fragmenten haben wir noch ein referenzprimerset, das wir aus wien bekommen haben, eingesetzt. bei den mussten wir aber vorher noch die konzentration messen und anpassen, da sie uns nicht bekannt war.

nachdem beide pcr fertg ware, legten wir die ergebnis schnell auf eis und entnahmen 20µl zum ansetzen einer gel-eletrophorese. das ergebnis füge ich hier ein:

zur genaueren erläuterung was hier zu sehen ist: das erste bandenmuster ist eine vergleichsleiter für fragmente im hundrterberreich, danach kommen die 5 kurzen stücke plus den referenzprimer und dann eine refernzleiter für 1000-3000Bp. stark sichtbar ist die 17er probe in allen konzentrationen (40ng, 20ng & 10ng), wesentlich schwächer die probe für #19. dahinter (nicht erkennbar) eine probe ohne primer und eine ohne DNA zur krontrolle (die beiden haben wir bei der PCR für 17&19 mitangesetzt, hätten wir hier banden bekommen wäre irgendwo eine verunreinigung mit dna festzustellen gewesen)

Den rest des pcr-produktes (etwas 30µl) haben wir mit unserem kit aufgereinigt und die konzentrationen gemessen. nachdem wir sie entsprechend den vorgaben der sequezierfirma angepasst hatten, wurden sie abschickfertig gemacht und eingekühlt (abhohlung solcher dinge findet üblicherweiße um 4 statt, wir verließen das labor erst um halb 7)

ursprünglich wollte ich die primer für die nächste pcr bereits aufnehmen, hatte mich aber in der einsortierung geirrt und alle bereits aufgenommenen noch einmal mit wasser versetzt :(

um ein dna-fragment zum sequenzieren einschicken zu können, muss seine lösung frei von salzen, polymerase und nicht erwünschten dna-fragmenten sein. das alles befindet sich aber noch im pcr-produkt, deshlalb verwenden wir ein PCR clean-up kit, dass sogar dafür geeignet ist aus gel reine fragmentlösung herauszulösen (hätten wir in einem pcr produkt fragmete einer anderen länge gehabt, aber sonst keine zwischenprodukte, hätten wir nur die gewünschte bande ausgeschnitten und mit diesem kit auch sequenzierfertig machen können)

In unserem kit bekamen wir einen binding buffer, einen waschbuffer, einen elution buffer,spezielle patentierte säulchen mit einer membran und auffangbehälter.

die buffer verdünnten wir zuerst mit ethanol, da die lieferung noch in hochkonzentriertem zustand (zur besseren lagerung) war.

um ein pcr produkt aufzureinigen wird es zuerst in die doppelte menge binding buffer pipettiert. diese mischung wird mit dem vortexer homogen gemacht und mit der kleinen zentrifuge etwaige spritzer wieder nach unten befördert. der inhalt der epis wird nun in die säulchen gegeben und diese mitsamt des auffangbehälters in der großen zetrifuge 1min bei 11 tausendfacher erdanziehung zentrifugiert. dabie wird der überschüssige binding buffer durch die membran in das auffanggefäß befördert und die gewünschten fragmente an das säulchen gebunden. die flüssigkeit im auffangbehälter wird herauspipettiert. dann werden 700µl des waschbuffers hinzugefügt und bei den selben bedingungen zentrifugiert. dieser buffer nimmt alles an salzen, polymerase oder sonstigen proteinen mit sich, außer die gebundenen dna-fragmente natürlich. was sich unten abgesetzt hat wird wieder herauspipettiert. um jegliche reste des waschbuffers zu entfernen un die membran zu trocken wird 5 min zentrifugiert. danach kann man die auffangbehälter wegwerfen und die säulchen werden in frische epis gegeben. nun wird mit großer vorsicht 30 µl destiliertes wasser auf die membran aufgebracht und eine minute inkubationszeit abgewartet. das wasser löst die fragmente wieder aus dem säulchen und diese wandert bei einer weiteren minute zentrifugieren mit dem wasser mit nach unten. im kit wäre ein spezieller elution buffer enthalten, aber wir verwenden ihn nicht, weil die vorgaben der firma bei der wir die dna-fagmente equenzieren lassen, eine lösung in wasser verlangen. dass das lösen mit wasser bei unserem auch kit möglich ist, darauf wurde beim kauf natürlich geachtet.

nach dem aufreinigen des pcr produktes wird noch die konzentration gemessen und durch verdünnung (bzw in vorgelegtes wasser pipettieren) die konzentration erzielt, die die sequenzierfirma als am besten geeignet festgestellt hat.

um unsere proben einschicken zu können, müssen sie nur noch einmal mit dem verwendeten forward und einmal mit dem reverse primer in extra epis pipettiert werden. dann sind sie nach dem aufkleben von etiketten komplett fertig. und wir können nur mehr auf die sequenzierergebnisse warten.

das prinzip der geleletrophorese kenne ich bereits aus dem unterricht und habe sie bei einem tag im vienna open lab im zuge von DNA-Fingerprinting bereits selbst verwendet. bei der agarose-gelelektrophorese wird eine dna-probe (meist pcr-produkt) in taschen des gels pipettiert und durch das anschließen von strom wird am gegenüberliegenden ende ein positiver pol erzeugt zu dem die (wegen dem phosphorsäurerest) negativ geladene DNA wandert. das die agarose ein dichtes netztwerk bildet kommen kurze stücke schneller voran als längere ud die dna-fragmente trennen sich nach ihrer länge auf. das ergibt beim dna.fingerprinting das übliche bandenmuster.
Die benötigte appartur besteht aus einem aragose-gelblock mit taschen zum "laden". einem buffer der darüber geschichtet wird und einem natürlich stromanschluss.



Zuerst wird die mit einem buffer versetzte erwärmte agarose in einen behälter gegossen und ein spezieller kamm hineingesteckt um beim abkühlen die taschen( in die die probe hinein pipettiert wird) zu erhalten. bei unserem versuchen wird die agarose mit ethidiumbromid (ein farbstoff der sich sehr gut in die DNA einlagert) versetzt. Da ethidiumbromid in verdacht ist hochmutagen zu sein und innerhalb weniger sekunden selbst bei geringen konzentrationen durch die üblichen latexhandschuhe durchdring und von der haut aufgenommen wird, werden beim umgang mit dem farbstoff spezielle handschuhe getragen die kaum durchlässig sind.

Nach dem abkühlen des gels wird der kamm herausgenommen und der gelblock in die bufferlösung gelegt bzw soll auch damit bedeckt sein. unser PCR produkt haben wir zuvor mit einem loading buffer versetzt, der sowohl das pipettieren in die laschen leichter macht (er enthält glycerin, dadurch ist er schwerer als der buffer darüber und sinkt in die taschne ab), als auch zeigt wie weit die dna-fragmente bereits im gel gewandert sind (durch einen zugesetzten farbstoff).
Nach dem hineinpipettieren in die taschen des gels wird der strom angeschlossen und die dna-stücke beginnen sich zum positiven pol zu bewegen.
wir haben neben unseren zu untersuchenden proben auch noch vergleichsproben pipettiert, bei denen die länge der fragmente bereits bekannt ist und man dementsprechend im vergleich mit diesen proben die länge der unsrigen ungefähr feststellen könnte.(beim primerdesign lege ich die länge bereits fest, der vergleich dient also wiederum der kontrolle)

wir verwenden die gelelektrophorese als kontrolle, ob unser pcr produkt eindeutig ist. Sichtbar gemacht wird das Bandenmuster durch UV-Licht und in unserem fall, ist an dieses gerät auch ein computer angeschlossen, mit dem man das bild in einer kurzen beleutungsperiode festhalten kann und dadurch die dna nicht durch lange UV-einstrahlung zerstört wird.

durch den einsatz eines bestimten enzyms, genannt polymerase, kann DNA auch in vitro vervielfältigt werden.

prinzipiell gibt es 3 Schritte, die einen zyklus darstellen (es werden in unserem fall immer 35 zyklen gemacht. davor wird extra erhitzt um die primer und die dna sicher in einzelstränge aufzulösen)

1. Denaturierung: durch erhitzen auf mehr als 90°C lösen sich die wasserstoffbrücken der DNA-Doppelhelix und es sind nur noch einzelstränge vorhanden.
2. Annealing: die Primer binden sich an die DNA, was bei einer geringeren temperatur stattfindend (ich nehme 64°C, da ich meine primer extra darauf optimiert habe)
3. Verlängerung: die polymerase arbeitet bei etwa 72°C. bei der PCR die ich gemacht habe, hadelt es sich aber nicht um eine der für DNA-fingerprinting üblichen Taq-Polymerasen sondern um eine hoch genaue spezielle Polymerase, die auch bei höheren temperaturen noch arbeiten könnte und eine sogenannte exonuklease aktivität besitzt, was bedeutet: bei lesefehlern baut sie die letzten paar basenppare wieder ab und setzt sich somit selbst zurück um den fehler zu korrigieren.

am ende meiner 35 zyklen wird noch eine sogenannte "final extension" für 5 min gemacht, damit auch die enden exakt sind. danach wird heruntergekühlt auf 4°C und das PCR Produkt auf eis gelegt um die aktivität der polymerase zu beenden (sie würde sonst augrund ihrer exonuklease funktion meine gewünschten produkte wieder zersetzten)

"Die Polymerase-Kettenreaktion findet in einem sogenannten Thermocycler statt. Diese Maschine erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionsgefäße präzise auf die Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird. Um Verdunstung zu verhindern, wird ein dicht schließendes Reaktionsgefäß verwendet. Etwaige Kondensatbildung im Deckel des Gefäßes wird durch einen beheizbaren Gerätedeckel (über 100 °C) verhindert.'" Quelle Wikipedia

letzte woche dienstag habe ich mich dann noch genauer mit PCR, Pipettierschemen, Temepraturprogrammen und Aufreinigung des PCR-Produktes beschäftigt.
nach meiner laboreinführungam mittwoch habe ich fleißig pipetieren geübt. mein betreuer war aber am donnerstag nicht da, deshalb konnten wir nicht mit der tatsächlichen Laborarbeit beginnen, sondern ich habe an der Datenbank gearbeitet. dabei habe ich bereits bekannte proteine des BL21(DE3) (der E. coli Stamm, an dem ich bereits gearbeitet habe ) mit der Datenbank abgeglichen und besonders auf den vergleich mit einen K12 stamm geachtet. releveant war diese manuelle untersuchung aufgrund der tatsache, dass das momentan benutze programm zum abgleich bereits bei geringsten längenunterschieden oder verschiebungen innerhalb der sequenz, das protein nicht als das gleiche erkennt.

Freitags begann dann tatsächlich de erste Arbeit im LABOR. die bestellten primersets, DNA und vergleichsprimer aus Wien waren bereits in der vorwoche angekommen, genauso wie das Clean-up-Kit.
Der erste schritt war die Primer aufzunehmen. Wir sortierten diejenigen für die ersten 5 einfachen stellen und die 2 kürzeren, die mit inner primern zum sequenzieren eingeschickt werden sollten heraus und versetzten sie mit soviel "Fresenius"-Wasser (doppelt destilliertes Wasser wird in diesem labor meist von derselben firma verwendet und deshalb auch so genannt), dass wir eine ungefähre konzentration von 100nmol/ml bekommen. Da die tatsächliche konzentration der uns geschickten DNA unsicher war, haben wir sie im "Nano-Drop" mehrmals bestimmt und ein pipettierschema entwickelt.

Prinzipiell muss ich die DNA verdünnen, bei unserer ersten PCR wollten wir dabei konzentrationen von 40, 20 und 10ng/µl austesten. Auch die primer mussten noch mehr verdünnt werden: um eine konzentration von 5pmol/µl zu bekommen, werden 5µl der bereits hergestellten Lösung (c=100pmol/µl) in 95µl vorgelegtes H2O pipettiert.
Für die PCR erstelle ich zuerst einen Mastermix für mehrere Ansätze (dadurch wird das pipettieren einfacher). Für die üblche zusammensetzung hatte ich eine vorlage der firma, von der wir auch die polymerase bestellt hatten. Hinein kommt: Wasser (um die anderen Bestandteile zu lösen), Polymerase(ein Enzym, dass den einen komplementären DNA-strang synthetisieren kann), GC-Buffer(erleichtert bzw verbessert die arbeit der polymerase bei GC-reichen regionen und daraus folgenden komplizierteren sekundärstrukturen), dNTP(enthält die nukleotide, die die polymerase zu einem komplememtären strang "zusammenbauen" wird) und DMSO(verhindert die Ausbildung von Sekundärstrukturen der template DNA und erleichtert damit besonders die Amplifikation von GC-reicher DNA).

die zusammensetzung des Mastermixes basiert auf folgendem Mengenschema:
hochreindestilliertes Wasser vorlegen ergänzend auf 50µl im pcr-Gefäß insgesamt (bei uns meist 17µl)
10µl GC-Buffer
1,5 µl DMSO
1µl dNTP
0,5 µl Polymerase

dazu kommt in meinem fall meist 10µl verdünnte DNA und je 5µl der Primer

wenn die konzentrationen von meiner ansonst eingestellten einheit abweichen verändert sich der genaue anteil an wasser, welches ich entweder mit vorlege oder die letzte differenz auf 50µl hinzufüge.

prinzpiell erstelle ich den mastermix ja für mehrere pcr-ansätze um mir pipettierarbeit zu ersparen, demenstprechend werden die mengenangaben multipliziert bzw immer mindestens ein ansatz extra gerechnet um ja nirgends zu wenig zu haben.