LABOR!!!
15:36 / 24.08.2010
letzte woche dienstag habe ich mich dann noch genauer mit PCR, Pipettierschemen, Temepraturprogrammen und Aufreinigung des PCR-Produktes beschäftigt.
nach meiner laboreinführungam mittwoch habe ich fleißig pipetieren geübt. mein betreuer war aber am donnerstag nicht da, deshalb konnten wir nicht mit der tatsächlichen Laborarbeit beginnen, sondern ich habe an der Datenbank gearbeitet. dabei habe ich bereits bekannte proteine des BL21(DE3) (der E. coli Stamm, an dem ich bereits gearbeitet habe ) mit der Datenbank abgeglichen und besonders auf den vergleich mit einen K12 stamm geachtet. releveant war diese manuelle untersuchung aufgrund der tatsache, dass das momentan benutze programm zum abgleich bereits bei geringsten längenunterschieden oder verschiebungen innerhalb der sequenz, das protein nicht als das gleiche erkennt.
Freitags begann dann tatsächlich de erste Arbeit im LABOR. die bestellten primersets, DNA und vergleichsprimer aus Wien waren bereits in der vorwoche angekommen, genauso wie das Clean-up-Kit.
Der erste schritt war die Primer aufzunehmen. Wir sortierten diejenigen für die ersten 5 einfachen stellen und die 2 kürzeren, die mit inner primern zum sequenzieren eingeschickt werden sollten heraus und versetzten sie mit soviel "Fresenius"-Wasser (doppelt destilliertes Wasser wird in diesem labor meist von derselben firma verwendet und deshalb auch so genannt), dass wir eine ungefähre konzentration von 100nmol/ml bekommen. Da die tatsächliche konzentration der uns geschickten DNA unsicher war, haben wir sie im "Nano-Drop" mehrmals bestimmt und ein pipettierschema entwickelt.
Prinzipiell muss ich die DNA verdünnen, bei unserer ersten PCR wollten wir dabei konzentrationen von 40, 20 und 10ng/µl austesten. Auch die primer mussten noch mehr verdünnt werden: um eine konzentration von 5pmol/µl zu bekommen, werden 5µl der bereits hergestellten Lösung (c=100pmol/µl) in 95µl vorgelegtes H2O pipettiert.
Für die PCR erstelle ich zuerst einen Mastermix für mehrere Ansätze (dadurch wird das pipettieren einfacher). Für die üblche zusammensetzung hatte ich eine vorlage der firma, von der wir auch die polymerase bestellt hatten. Hinein kommt: Wasser (um die anderen Bestandteile zu lösen), Polymerase(ein Enzym, dass den einen komplementären DNA-strang synthetisieren kann), GC-Buffer(erleichtert bzw verbessert die arbeit der polymerase bei GC-reichen regionen und daraus folgenden komplizierteren sekundärstrukturen), dNTP(enthält die nukleotide, die die polymerase zu einem komplememtären strang "zusammenbauen" wird) und DMSO(verhindert die Ausbildung von Sekundärstrukturen der template DNA und erleichtert damit besonders die Amplifikation von GC-reicher DNA).
die zusammensetzung des Mastermixes basiert auf folgendem Mengenschema:
hochreindestilliertes Wasser vorlegen ergänzend auf 50µl im pcr-Gefäß insgesamt (bei uns meist 17µl)
10µl GC-Buffer
1,5 µl DMSO
1µl dNTP
0,5 µl Polymerase
dazu kommt in meinem fall meist 10µl verdünnte DNA und je 5µl der Primer
wenn die konzentrationen von meiner ansonst eingestellten einheit abweichen verändert sich der genaue anteil an wasser, welches ich entweder mit vorlege oder die letzte differenz auf 50µl hinzufüge.
prinzpiell erstelle ich den mastermix ja für mehrere pcr-ansätze um mir pipettierarbeit zu ersparen, demenstprechend werden die mengenangaben multipliziert bzw immer mindestens ein ansatz extra gerechnet um ja nirgends zu wenig zu haben.
nach meiner laboreinführungam mittwoch habe ich fleißig pipetieren geübt. mein betreuer war aber am donnerstag nicht da, deshalb konnten wir nicht mit der tatsächlichen Laborarbeit beginnen, sondern ich habe an der Datenbank gearbeitet. dabei habe ich bereits bekannte proteine des BL21(DE3) (der E. coli Stamm, an dem ich bereits gearbeitet habe ) mit der Datenbank abgeglichen und besonders auf den vergleich mit einen K12 stamm geachtet. releveant war diese manuelle untersuchung aufgrund der tatsache, dass das momentan benutze programm zum abgleich bereits bei geringsten längenunterschieden oder verschiebungen innerhalb der sequenz, das protein nicht als das gleiche erkennt.
Freitags begann dann tatsächlich de erste Arbeit im LABOR. die bestellten primersets, DNA und vergleichsprimer aus Wien waren bereits in der vorwoche angekommen, genauso wie das Clean-up-Kit.
Der erste schritt war die Primer aufzunehmen. Wir sortierten diejenigen für die ersten 5 einfachen stellen und die 2 kürzeren, die mit inner primern zum sequenzieren eingeschickt werden sollten heraus und versetzten sie mit soviel "Fresenius"-Wasser (doppelt destilliertes Wasser wird in diesem labor meist von derselben firma verwendet und deshalb auch so genannt), dass wir eine ungefähre konzentration von 100nmol/ml bekommen. Da die tatsächliche konzentration der uns geschickten DNA unsicher war, haben wir sie im "Nano-Drop" mehrmals bestimmt und ein pipettierschema entwickelt.
Prinzipiell muss ich die DNA verdünnen, bei unserer ersten PCR wollten wir dabei konzentrationen von 40, 20 und 10ng/µl austesten. Auch die primer mussten noch mehr verdünnt werden: um eine konzentration von 5pmol/µl zu bekommen, werden 5µl der bereits hergestellten Lösung (c=100pmol/µl) in 95µl vorgelegtes H2O pipettiert.
Für die PCR erstelle ich zuerst einen Mastermix für mehrere Ansätze (dadurch wird das pipettieren einfacher). Für die üblche zusammensetzung hatte ich eine vorlage der firma, von der wir auch die polymerase bestellt hatten. Hinein kommt: Wasser (um die anderen Bestandteile zu lösen), Polymerase(ein Enzym, dass den einen komplementären DNA-strang synthetisieren kann), GC-Buffer(erleichtert bzw verbessert die arbeit der polymerase bei GC-reichen regionen und daraus folgenden komplizierteren sekundärstrukturen), dNTP(enthält die nukleotide, die die polymerase zu einem komplememtären strang "zusammenbauen" wird) und DMSO(verhindert die Ausbildung von Sekundärstrukturen der template DNA und erleichtert damit besonders die Amplifikation von GC-reicher DNA).
die zusammensetzung des Mastermixes basiert auf folgendem Mengenschema:
hochreindestilliertes Wasser vorlegen ergänzend auf 50µl im pcr-Gefäß insgesamt (bei uns meist 17µl)
10µl GC-Buffer
1,5 µl DMSO
1µl dNTP
0,5 µl Polymerase
dazu kommt in meinem fall meist 10µl verdünnte DNA und je 5µl der Primer
wenn die konzentrationen von meiner ansonst eingestellten einheit abweichen verändert sich der genaue anteil an wasser, welches ich entweder mit vorlege oder die letzte differenz auf 50µl hinzufüge.
prinzpiell erstelle ich den mastermix ja für mehrere pcr-ansätze um mir pipettierarbeit zu ersparen, demenstprechend werden die mengenangaben multipliziert bzw immer mindestens ein ansatz extra gerechnet um ja nirgends zu wenig zu haben.
