PCR-polymerase chain reaction
18:43 / 24.08.2010
durch den einsatz eines bestimten enzyms, genannt polymerase, kann DNA auch in vitro vervielfältigt werden.
prinzipiell gibt es 3 Schritte, die einen zyklus darstellen (es werden in unserem fall immer 35 zyklen gemacht. davor wird extra erhitzt um die primer und die dna sicher in einzelstränge aufzulösen)
1. Denaturierung: durch erhitzen auf mehr als 90°C lösen sich die wasserstoffbrücken der DNA-Doppelhelix und es sind nur noch einzelstränge vorhanden.
2. Annealing: die Primer binden sich an die DNA, was bei einer geringeren temperatur stattfindend (ich nehme 64°C, da ich meine primer extra darauf optimiert habe)
3. Verlängerung: die polymerase arbeitet bei etwa 72°C. bei der PCR die ich gemacht habe, hadelt es sich aber nicht um eine der für DNA-fingerprinting üblichen Taq-Polymerasen sondern um eine hoch genaue spezielle Polymerase, die auch bei höheren temperaturen noch arbeiten könnte und eine sogenannte exonuklease aktivität besitzt, was bedeutet: bei lesefehlern baut sie die letzten paar basenppare wieder ab und setzt sich somit selbst zurück um den fehler zu korrigieren.
am ende meiner 35 zyklen wird noch eine sogenannte "final extension" für 5 min gemacht, damit auch die enden exakt sind. danach wird heruntergekühlt auf 4°C und das PCR Produkt auf eis gelegt um die aktivität der polymerase zu beenden (sie würde sonst augrund ihrer exonuklease funktion meine gewünschten produkte wieder zersetzten)
"Die Polymerase-Kettenreaktion findet in einem sogenannten Thermocycler statt. Diese Maschine erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionsgefäße präzise auf die Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird. Um Verdunstung zu verhindern, wird ein dicht schließendes Reaktionsgefäß verwendet. Etwaige Kondensatbildung im Deckel des Gefäßes wird durch einen beheizbaren Gerätedeckel (über 100 °C) verhindert.'" Quelle Wikipedia
prinzipiell gibt es 3 Schritte, die einen zyklus darstellen (es werden in unserem fall immer 35 zyklen gemacht. davor wird extra erhitzt um die primer und die dna sicher in einzelstränge aufzulösen)
1. Denaturierung: durch erhitzen auf mehr als 90°C lösen sich die wasserstoffbrücken der DNA-Doppelhelix und es sind nur noch einzelstränge vorhanden.
2. Annealing: die Primer binden sich an die DNA, was bei einer geringeren temperatur stattfindend (ich nehme 64°C, da ich meine primer extra darauf optimiert habe)
3. Verlängerung: die polymerase arbeitet bei etwa 72°C. bei der PCR die ich gemacht habe, hadelt es sich aber nicht um eine der für DNA-fingerprinting üblichen Taq-Polymerasen sondern um eine hoch genaue spezielle Polymerase, die auch bei höheren temperaturen noch arbeiten könnte und eine sogenannte exonuklease aktivität besitzt, was bedeutet: bei lesefehlern baut sie die letzten paar basenppare wieder ab und setzt sich somit selbst zurück um den fehler zu korrigieren.
am ende meiner 35 zyklen wird noch eine sogenannte "final extension" für 5 min gemacht, damit auch die enden exakt sind. danach wird heruntergekühlt auf 4°C und das PCR Produkt auf eis gelegt um die aktivität der polymerase zu beenden (sie würde sonst augrund ihrer exonuklease funktion meine gewünschten produkte wieder zersetzten)
"Die Polymerase-Kettenreaktion findet in einem sogenannten Thermocycler statt. Diese Maschine erhitzt und kühlt die in ihr befindlichen Reaktionsgefäße präzise auf die Temperatur, die für den jeweiligen Schritt benötigt wird. Um Verdunstung zu verhindern, wird ein dicht schließendes Reaktionsgefäß verwendet. Etwaige Kondensatbildung im Deckel des Gefäßes wird durch einen beheizbaren Gerätedeckel (über 100 °C) verhindert.'" Quelle Wikipedia
