PCR-Produkt aufreinigen - clean-up kit
11:22 / 25.08.2010
um ein dna-fragment zum sequenzieren einschicken zu können, muss seine lösung frei von salzen, polymerase und nicht erwünschten dna-fragmenten sein. das alles befindet sich aber noch im pcr-produkt, deshlalb verwenden wir ein PCR clean-up kit, dass sogar dafür geeignet ist aus gel reine fragmentlösung herauszulösen (hätten wir in einem pcr produkt fragmete einer anderen länge gehabt, aber sonst keine zwischenprodukte, hätten wir nur die gewünschte bande ausgeschnitten und mit diesem kit auch sequenzierfertig machen können)
In unserem kit bekamen wir einen binding buffer, einen waschbuffer, einen elution buffer,spezielle patentierte säulchen mit einer membran und auffangbehälter.
die buffer verdünnten wir zuerst mit ethanol, da die lieferung noch in hochkonzentriertem zustand (zur besseren lagerung) war.
um ein pcr produkt aufzureinigen wird es zuerst in die doppelte menge binding buffer pipettiert. diese mischung wird mit dem vortexer homogen gemacht und mit der kleinen zentrifuge etwaige spritzer wieder nach unten befördert. der inhalt der epis wird nun in die säulchen gegeben und diese mitsamt des auffangbehälters in der großen zetrifuge 1min bei 11 tausendfacher erdanziehung zentrifugiert. dabie wird der überschüssige binding buffer durch die membran in das auffanggefäß befördert und die gewünschten fragmente an das säulchen gebunden. die flüssigkeit im auffangbehälter wird herauspipettiert. dann werden 700µl des waschbuffers hinzugefügt und bei den selben bedingungen zentrifugiert. dieser buffer nimmt alles an salzen, polymerase oder sonstigen proteinen mit sich, außer die gebundenen dna-fragmente natürlich. was sich unten abgesetzt hat wird wieder herauspipettiert. um jegliche reste des waschbuffers zu entfernen un die membran zu trocken wird 5 min zentrifugiert. danach kann man die auffangbehälter wegwerfen und die säulchen werden in frische epis gegeben. nun wird mit großer vorsicht 30 µl destiliertes wasser auf die membran aufgebracht und eine minute inkubationszeit abgewartet. das wasser löst die fragmente wieder aus dem säulchen und diese wandert bei einer weiteren minute zentrifugieren mit dem wasser mit nach unten. im kit wäre ein spezieller elution buffer enthalten, aber wir verwenden ihn nicht, weil die vorgaben der firma bei der wir die dna-fagmente equenzieren lassen, eine lösung in wasser verlangen. dass das lösen mit wasser bei unserem auch kit möglich ist, darauf wurde beim kauf natürlich geachtet.
nach dem aufreinigen des pcr produktes wird noch die konzentration gemessen und durch verdünnung (bzw in vorgelegtes wasser pipettieren) die konzentration erzielt, die die sequenzierfirma als am besten geeignet festgestellt hat.
um unsere proben einschicken zu können, müssen sie nur noch einmal mit dem verwendeten forward und einmal mit dem reverse primer in extra epis pipettiert werden. dann sind sie nach dem aufkleben von etiketten komplett fertig. und wir können nur mehr auf die sequenzierergebnisse warten.
In unserem kit bekamen wir einen binding buffer, einen waschbuffer, einen elution buffer,spezielle patentierte säulchen mit einer membran und auffangbehälter.
die buffer verdünnten wir zuerst mit ethanol, da die lieferung noch in hochkonzentriertem zustand (zur besseren lagerung) war.
um ein pcr produkt aufzureinigen wird es zuerst in die doppelte menge binding buffer pipettiert. diese mischung wird mit dem vortexer homogen gemacht und mit der kleinen zentrifuge etwaige spritzer wieder nach unten befördert. der inhalt der epis wird nun in die säulchen gegeben und diese mitsamt des auffangbehälters in der großen zetrifuge 1min bei 11 tausendfacher erdanziehung zentrifugiert. dabie wird der überschüssige binding buffer durch die membran in das auffanggefäß befördert und die gewünschten fragmente an das säulchen gebunden. die flüssigkeit im auffangbehälter wird herauspipettiert. dann werden 700µl des waschbuffers hinzugefügt und bei den selben bedingungen zentrifugiert. dieser buffer nimmt alles an salzen, polymerase oder sonstigen proteinen mit sich, außer die gebundenen dna-fragmente natürlich. was sich unten abgesetzt hat wird wieder herauspipettiert. um jegliche reste des waschbuffers zu entfernen un die membran zu trocken wird 5 min zentrifugiert. danach kann man die auffangbehälter wegwerfen und die säulchen werden in frische epis gegeben. nun wird mit großer vorsicht 30 µl destiliertes wasser auf die membran aufgebracht und eine minute inkubationszeit abgewartet. das wasser löst die fragmente wieder aus dem säulchen und diese wandert bei einer weiteren minute zentrifugieren mit dem wasser mit nach unten. im kit wäre ein spezieller elution buffer enthalten, aber wir verwenden ihn nicht, weil die vorgaben der firma bei der wir die dna-fagmente equenzieren lassen, eine lösung in wasser verlangen. dass das lösen mit wasser bei unserem auch kit möglich ist, darauf wurde beim kauf natürlich geachtet.
nach dem aufreinigen des pcr produktes wird noch die konzentration gemessen und durch verdünnung (bzw in vorgelegtes wasser pipettieren) die konzentration erzielt, die die sequenzierfirma als am besten geeignet festgestellt hat.
um unsere proben einschicken zu können, müssen sie nur noch einmal mit dem verwendeten forward und einmal mit dem reverse primer in extra epis pipettiert werden. dann sind sie nach dem aufkleben von etiketten komplett fertig. und wir können nur mehr auf die sequenzierergebnisse warten.
