nested PCR
10:20 / 26.08.2010
diese methode habe ich bei meinen letzten 7 abschnitten angewendet. da die umgebung zu uneindeutig war, musste ich die länge der stücke auf 2000 Basenpaare bis 4000Bp erweitern. solche stücke sind aber nicht sequenzierbar und deshalb setze ich nicht nur außen primer, sondern auch innen, wodurch ich dann wieder ein 400-500 Bp langes fragment erhalte.
dementsprechend musste ich für die nested pcr je 2 primersets designen und zuerst eine pcr für die äußeren, dann für die inneren primer ansetzen.
dienstags machten wir die pcr für die äußeren primer. zuerst mussten wir noch die konzentrationsmessung und anpassung eines vergleichsprimersets aus wien (das eine länge von 200Bp ergab) machen. wir erstellten einen mastermix inklusive dna der konzentration 20ng/µl und pipettierten davon 40µl in jeden pcr-tube und fügten die outer primer hinzu. aufgrund der unterschiedlichen basenlänge der proben benutzen wir 2 blöcke der pcr. einen für die fragmente der länge knapp über 2000 und einen für die um 4000Bp länge. die probe #18 setzte ich doppelt an, da diese stelle so kompliziert war, dass ich 2 inner primer sets benötigte um die zu sequenzierenden stellen in schöne stücke zu bekommen.
nach der pcr wurden wieder rund 30µl des pcr produktes mit dem clean-up kit aufgereinigt und die konzentrationen gemessen.
mittwoch morgen passte ich die konzentrationen der aufgereinigten pcr-produkte auf 2ng/µl an und mischte einen neuen mastermix an. diesmal kamen aber 5µl H2O mehr dazu, da ich vom verdünnten pcr-produkt nur 5 µl benötigte. das piepttieren der neuen pcr ansätze war sehr viel arbeit, da in jedes pcr-gefäß nicht nur die 2 inner primer, sondern auch die DNA (also das aufgereinigte verdünnte PCR-Produkt) exta hineinkam und jedes mal spitzen wechseln nötig war....
während die pcr fertig wurde, bereitete ich bereits den clean-up kit vor und mein betreuer das gel. danach fanden aufreinigen und längenkontrolle durch die elektrophorese paralell statt und nach dem mittagessen werteten wir die ergebnisse aus. das ist das ergebnis der längenkontrolle durch die gel-elektrophorese:
zuerst ist der referenzprimer und die 2000er stücke augetragen, darauf folgen die beiden 18er und die restlichten 4000er fragmente. dann kommt eine vergleichleiter für fragmente mit wenigen tausend Basenpaaren.der 2. abschnitt besteht aus den ergebnissen der 2. PCR (mit den inner primern) in aufsteigender zahlenreihenfolge (beginn mit einem referenzprimer, 18 wieder doppelt) und wir beendet von einer 100er leiter.
nach dem abgleich der ergebnisse der gelelektrophorese mit unseren berechneten längenangaben ginge wir wieder in labor und passten nach unseren messungen die konzenrationen des aufgereiningten pcr-endprodukte an.
zu 10µl pcr-produkt der konzentration 10ng/µl gaben wir 4µl der auf 5pmol/µl verdünnten primer (einmal forward, einmal reverse) und schickten diese mischung an die sequenzierfirma.
dementsprechend musste ich für die nested pcr je 2 primersets designen und zuerst eine pcr für die äußeren, dann für die inneren primer ansetzen.
dienstags machten wir die pcr für die äußeren primer. zuerst mussten wir noch die konzentrationsmessung und anpassung eines vergleichsprimersets aus wien (das eine länge von 200Bp ergab) machen. wir erstellten einen mastermix inklusive dna der konzentration 20ng/µl und pipettierten davon 40µl in jeden pcr-tube und fügten die outer primer hinzu. aufgrund der unterschiedlichen basenlänge der proben benutzen wir 2 blöcke der pcr. einen für die fragmente der länge knapp über 2000 und einen für die um 4000Bp länge. die probe #18 setzte ich doppelt an, da diese stelle so kompliziert war, dass ich 2 inner primer sets benötigte um die zu sequenzierenden stellen in schöne stücke zu bekommen.
nach der pcr wurden wieder rund 30µl des pcr produktes mit dem clean-up kit aufgereinigt und die konzentrationen gemessen.
mittwoch morgen passte ich die konzentrationen der aufgereinigten pcr-produkte auf 2ng/µl an und mischte einen neuen mastermix an. diesmal kamen aber 5µl H2O mehr dazu, da ich vom verdünnten pcr-produkt nur 5 µl benötigte. das piepttieren der neuen pcr ansätze war sehr viel arbeit, da in jedes pcr-gefäß nicht nur die 2 inner primer, sondern auch die DNA (also das aufgereinigte verdünnte PCR-Produkt) exta hineinkam und jedes mal spitzen wechseln nötig war....
während die pcr fertig wurde, bereitete ich bereits den clean-up kit vor und mein betreuer das gel. danach fanden aufreinigen und längenkontrolle durch die elektrophorese paralell statt und nach dem mittagessen werteten wir die ergebnisse aus. das ist das ergebnis der längenkontrolle durch die gel-elektrophorese:
zuerst ist der referenzprimer und die 2000er stücke augetragen, darauf folgen die beiden 18er und die restlichten 4000er fragmente. dann kommt eine vergleichleiter für fragmente mit wenigen tausend Basenpaaren.der 2. abschnitt besteht aus den ergebnissen der 2. PCR (mit den inner primern) in aufsteigender zahlenreihenfolge (beginn mit einem referenzprimer, 18 wieder doppelt) und wir beendet von einer 100er leiter.
nach dem abgleich der ergebnisse der gelelektrophorese mit unseren berechneten längenangaben ginge wir wieder in labor und passten nach unseren messungen die konzenrationen des aufgereiningten pcr-endprodukte an.
zu 10µl pcr-produkt der konzentration 10ng/µl gaben wir 4µl der auf 5pmol/µl verdünnten primer (einmal forward, einmal reverse) und schickten diese mischung an die sequenzierfirma.
