neues und vertrautes....eine ganz andere aufgabe
10:25 / 01.09.2010
freitag nachmittags erhielt ich von meinem betreuer eine einweisung in das projekt meiner arbeitskollegin (eine andere praktikantin, die von FIT hierher gekommen war).
es geht dabei um den vergleich einander verwandter bzw voneinader abgeleitete E. coli-stämme. mache waren bereist voll sequenziert wie der an dem ich zuvor gearbeitet hatte, andere teilweise bekannt und wieder andere wurden aus dem abgleich von bereits sequenzierten verwandten stämmen und bereits erhaltenen eigenen sequezierdaten zusammengesetzt.
meine erste aufgabe war es primer zu designen um festzustellen wie sich in einem bestimmten stamm (an dessen "zusammenbau" des genoms meine arbeitskollegin bereits länger arbeitete) größere abschnitte der DNA tatsächlich angeordnet hatten (zwischen den stämmen gibt es durch drehungen von fragmenten und anderen faktoren immer wieder unterschiede, wo sich bestimmte abschnitte im gesamtgenom befinden).
ich arbeitete also im bereits sequenzierten genom eines vergleichsstammes um die primer zu designen und musste die erhaltenen dann sowohl gegen die datenbank des bereits komplett bekannten stammes als auch gegen die beiden vermuteten variatonen unseres zu untersuchenden stammes blasten und danach meine primer auswählen.
währenddessen arbeitete meine kollegin mit hilfe neuer vergleichsdaten weiter und kam ganz ohne labor mit einem computerprogramm zum gewünschten ergebnis (in welcher abfolge sich die fragmente mit höchster wahrscheinlichkeit befinden).
somit wurden die primer nicht mehr gebraucht und ich bekam eine neue aufgabe: in einem anderen zu untersuchenden stamm (dessen untersuchung bereits wesentlich weiter fortgeschritten war), gab es zwischen vielen bekannten abschnitten immer noch einige löcher völlig ohne information. dafür sollte ich primer designen, um durch laborergebnisse an unsere benötigten sequenzierinformationen zu kommen.
ich sollte 6 stellen untersuchen, wobei 4 zwischen 400 und 600 bp lang waren. um die eindeutigkeit unserer sequenzierergebnisse zu gewährleisten und zuordnen der stelle im genom zu ermöglichen, musste ich um die gesuchten stellen enstprechend noch platz lassen, was die fragmente dementsprechend verlängert. smit entsprachen sie zwar nicht mehr den optimalbedingungen (die ich bei meinen allerersten primersätzen angestrebt habe, da da nur einzelne unstimmigkeiten in der sequenz aufzulösen waren), aber die technik der sequenzierfirma hat sich auch bei fragmenten dieser länge durchaus als gut erwiesen und die angestrebte qualität ist trotzdem gewährleistet. bei den anderen beiden stellen wird es etwas schwieriger: das eine hat 750bp und mit dem sicherheitsabstand werde ich ein fragment der länge von 900bp erhalten. dadurch überlappen sich die ergbenisse des forward und reward primers nicht mehr, wir sollten aber trotz allem ein schönes ergebnis bekommen.
der letzte kandidat ist mit wesentlich mehr arbeit verbunden. die zu füllende lücke ist mehr als 4500bp lang. ich habe ein erstes primerset dafür designt. mit den ergebnissen unserer 1. pcr werden wir auf beiden seiten randstellen von 500 bis 700bp sequenzieren können. in diese neu festgestellten regionen werde wieder primer designt, die das loch um weitere 1000 verkürzen sollten. so arbeitet man sich nach immer weiter innen, bis sich die primer überlappen oder davor unbestimmte fragmente der region zuordnen lassen und noch mehr daten liefern.
dienstag nachmittag stellte ich die 6 primersets fertig und mein betreuer designte selbst noch ein paar weitere für ein anderes projekt um dien bestellumfang zu erhöhen. die bestellung der primer ging noch am selben tag raus und sie sollten morgen da sein. wenn bis dahin auch noch die benötigte dna der unterschiedlichen stämme angekommen ist, kann ich wieder im labor arbeiten.
PS: der stamm unserer vergleichsstudie, die wir korrigieren wollten ist scheinbar momentan nicht verfügbar, denn er ist eingegangen. vll findet der betreuer der stämme in wien noch ein paar tiefgekühlte proben der dna, sonst können wir nur die dna unseres eigenen stammes noch einmal untersuchen. weiteres wird sich weisen...
es geht dabei um den vergleich einander verwandter bzw voneinader abgeleitete E. coli-stämme. mache waren bereist voll sequenziert wie der an dem ich zuvor gearbeitet hatte, andere teilweise bekannt und wieder andere wurden aus dem abgleich von bereits sequenzierten verwandten stämmen und bereits erhaltenen eigenen sequezierdaten zusammengesetzt.
meine erste aufgabe war es primer zu designen um festzustellen wie sich in einem bestimmten stamm (an dessen "zusammenbau" des genoms meine arbeitskollegin bereits länger arbeitete) größere abschnitte der DNA tatsächlich angeordnet hatten (zwischen den stämmen gibt es durch drehungen von fragmenten und anderen faktoren immer wieder unterschiede, wo sich bestimmte abschnitte im gesamtgenom befinden).
ich arbeitete also im bereits sequenzierten genom eines vergleichsstammes um die primer zu designen und musste die erhaltenen dann sowohl gegen die datenbank des bereits komplett bekannten stammes als auch gegen die beiden vermuteten variatonen unseres zu untersuchenden stammes blasten und danach meine primer auswählen.
währenddessen arbeitete meine kollegin mit hilfe neuer vergleichsdaten weiter und kam ganz ohne labor mit einem computerprogramm zum gewünschten ergebnis (in welcher abfolge sich die fragmente mit höchster wahrscheinlichkeit befinden).
somit wurden die primer nicht mehr gebraucht und ich bekam eine neue aufgabe: in einem anderen zu untersuchenden stamm (dessen untersuchung bereits wesentlich weiter fortgeschritten war), gab es zwischen vielen bekannten abschnitten immer noch einige löcher völlig ohne information. dafür sollte ich primer designen, um durch laborergebnisse an unsere benötigten sequenzierinformationen zu kommen.
ich sollte 6 stellen untersuchen, wobei 4 zwischen 400 und 600 bp lang waren. um die eindeutigkeit unserer sequenzierergebnisse zu gewährleisten und zuordnen der stelle im genom zu ermöglichen, musste ich um die gesuchten stellen enstprechend noch platz lassen, was die fragmente dementsprechend verlängert. smit entsprachen sie zwar nicht mehr den optimalbedingungen (die ich bei meinen allerersten primersätzen angestrebt habe, da da nur einzelne unstimmigkeiten in der sequenz aufzulösen waren), aber die technik der sequenzierfirma hat sich auch bei fragmenten dieser länge durchaus als gut erwiesen und die angestrebte qualität ist trotzdem gewährleistet. bei den anderen beiden stellen wird es etwas schwieriger: das eine hat 750bp und mit dem sicherheitsabstand werde ich ein fragment der länge von 900bp erhalten. dadurch überlappen sich die ergbenisse des forward und reward primers nicht mehr, wir sollten aber trotz allem ein schönes ergebnis bekommen.
der letzte kandidat ist mit wesentlich mehr arbeit verbunden. die zu füllende lücke ist mehr als 4500bp lang. ich habe ein erstes primerset dafür designt. mit den ergebnissen unserer 1. pcr werden wir auf beiden seiten randstellen von 500 bis 700bp sequenzieren können. in diese neu festgestellten regionen werde wieder primer designt, die das loch um weitere 1000 verkürzen sollten. so arbeitet man sich nach immer weiter innen, bis sich die primer überlappen oder davor unbestimmte fragmente der region zuordnen lassen und noch mehr daten liefern.
dienstag nachmittag stellte ich die 6 primersets fertig und mein betreuer designte selbst noch ein paar weitere für ein anderes projekt um dien bestellumfang zu erhöhen. die bestellung der primer ging noch am selben tag raus und sie sollten morgen da sein. wenn bis dahin auch noch die benötigte dna der unterschiedlichen stämme angekommen ist, kann ich wieder im labor arbeiten.
PS: der stamm unserer vergleichsstudie, die wir korrigieren wollten ist scheinbar momentan nicht verfügbar, denn er ist eingegangen. vll findet der betreuer der stämme in wien noch ein paar tiefgekühlte proben der dna, sonst können wir nur die dna unseres eigenen stammes noch einmal untersuchen. weiteres wird sich weisen...
