Heute war eigentlich ein ganz ruhiger Tag, ohne jegliche Vorkommnisse und es hat alles wunderbar geklappt. Auf allen Gelen waren Banden zu sehen, und das ist schon sehr positiv. EIne Reihe von Proben ist noch in der PCR Maschine und steht bereit morgen auf die Gele aufgetragen zu werden. Dann ist mein PRojekt eigentlich beendet und ich bin jetzt schon froh das eigentlich alles so gut geklappt hat. Jetzt gehören die erhaltenen Werte nur noch ausgewertet und dargestellt, um sie die Ergebnisse dann im Protokol verwenden zu können.

Endlich hat's geklappt. Es sind Banden am Gel zu sehen. Die Aufgabe des heutigen TAges lag darin die PCRs mit unseren J774 und THP1 Zellen anzusetzten und noch einmal die cDNAs der HepG2-Zellen auf Gele aufzutragen und später im UV-Licht zu betrachten. Diesmal war es ein Erfolg. Die PRoben konnten ohne PRobleme ausgewertet werden. Morgen folgt noch das selbe SPiel mit den J774 und Thp1-ZEllen. Hoffentlich klappt's hier gleich beim ersten mal.

Die heutige Aufgabe bestand darin unsere J774 und THp1-Zellen für die PCR vorzubereiten. Weiters haben wir noch eine PCR mit hGAPDH Primern und unterschiedlichen cDNAs angesetzt, da ja wie bereits berichtet, diese cDNAs kaum BAnden am DNA Gel lieferten. Dann wurden noch zwei DNA GEle beladen. Das ERgebnis diesmal war wieder sehr komisch, DIesmal lieferten die mit hGAPDH Pimern beladenen cDNAs BAnden jedoch die HEpG2 Zellen mit hABCA1 Primern liefrten keine BAnden. Echt komisch das ganze. SO gibt es für die Schaumzellen noch keine effektiven Ergebnisse. Jedoch die Auswertung der ohne agg. LDL beladenen HEpG2s brachte das erwartete Ergebnis. Somit schon einmal ein Teilerfolg. So geht die Suche nach den Banden morgen weiter. Hoffentlich mit mehr Glück. Am Ende dieses Tages mussten im Zelllabor Zellen gesplittet werden.

Die letzte Woche hat begonnen. Da ich heute einen eigenen Computer auf meinen Arbeitsplatz bekomen habe, kann ich nun täglich über die Geschehnisse die sich im Labor ereignen zu berichten. Diese Woche wird großteils daraus bestehen, die gesamte isolierten RNAs der letzten beiden Wochen zu revers transkripieren und eine PCR durchzuführen. NAch jeder PCR werden die Proben auf ein DNA-GEl aufgetragen und unter dem UV Licht betrachtet. Klingt doch eigentlich ganz simple, Proben auf ein Gel aufzutragen. Ist es aber nicht immer, ruhige Hände sind gefragt. Der heutige Tag bestand großteils daraus 3 DNA-Gels zu beladen, und die Gele 35 min lang bei 90 V in ein Medium zu legen. Zuvor muss die cDNA der Proben jeweils gut mit einem Laufpuffer bestehend aus Glycerin, Bromphenolblau und Wasser. Auch die Agarosegels mussten zuerst selbst hergestellt werden. (Zusammensetzung: 6g Agarose, 395ml dest. Wasser und 5ml 40 fach TAE-Buffer)Dies wurde heute mit den HepG2-Zellen, welche mit agg. LDL und den Liganten beladen waren, gemacht. Weiters haben Heidi und ich noch eine PCR mit den letzten 12 Proben unserer HepG2-Zellen angesetzt. Dies muss morgen jedoch wahrscheinlich wiedrholt werden, da die ergebnisse doch zu wünschen übrig ließen. Bei den Kontrollen (hGapDH) war bei den 46 Proben lediglich eine Bande zu sehen. Echt komisch? Erklärung gibt es noch keine mal sehen wie es mit den letzten 12 Proben läuft. Für die PCRs morgen ist schon alles bereitgestellt, die Probensind verdünnt (1:10 und 1:100), also kann es morgen mit vollem Pogramm weiter gehen. Mal sehen was die morgigen Ergebnisse liefern. Jetzt sind nämlich die J774-(tierisch) und THP1(human)-Zellen an der Reihe. Ergebnisse werden folgen.........

Mit diesem Freitag ist nun eine weitere interessante und lehrreiche Woche im Labor zu Ende gegangen. Wie der Titel dieses Beitrages schon sagt, habe ich diese Woche sehr viel Zeit im Zelllabor verbracht. Die Arbeit im Zelllabor ist sehr interessant und auch aufregend. Es fiel auch schon vieles leichter, da man sich nach einer Woche natürlich schon ein wenig eingearbeitet hat. Bei einem so tollen Arbeitsumfeld ist es jedoch auch nicht schwer sich gut einzuleben. Nun hatte auch die zweite Woche alles zu bieten was zum Forscherleben so dazugehört. Waren es Analysen von Proben, Auswerten von Ergebnissen, als auch das Bearbeiten von Zellen. Natürlich waren die Ergebnisse beim ersten mal nicht gleich sehr aussagend, jedoch gehört natürlich auch das zum Forscherleben dazu. Jedoch ist es ja verständlich das ein nicht eindeutiges Ergebnis, die Annahmen gleich ausschließt. Aber nun konkret zur Woche zwei:

MONTAG

Der Montag morgen begann gleich im Zelllabor. Es war wieder an der Zeit unsere Zellen zu splitten. Bei den Zellen handelte es sich um RAW- und J774-Zellen. Die Zellen mussten wieder gesplittet werden, um das selbe mit ihnen zu machen als mit den HepG2-Zellen eine Woche zu vor. Zum Splitten der Zellen musste natürlich erst einmal wieder das Medium abgesaugt werden, danach wurden die Zellen mit PBS-Medium gewaschen und das PBS-Medium wurde nach dem Waschen wieder abgesaugt. Danach werden wir 7ml FCS-Medium in die Flasche, in welcher sich die Zellen befinden pipettiert. Die Zellen werden dann abgescrappt. Danach wird der Inhalt aus den Flaschen pipettiert. Ingesamt mussten 3 Flaschen RAW- und 3 Flaschen J774-Zellen abgescrappt werden. Danach wurden die Zellen in Sechserplatten aufgeteilt. 4 Platten für die RAW-Zellen und 4 Platten für die J774-Zellen. Es werden jeweils 1ml Zelllösung und 1,5ml FCS-Medium in eine Fläche der Sechserplatte pipettiert. Danach wurden die Zellen wieder im Inkubator verstaut. Weitere 8ml FCS-Medium und 2ml Zelllösung wurden in eine neue Flasche pipettiert, um die Zellen weiterzuzüchten, da immer eine große Nachfrage an Zellen (vor allem RAW-Zellen) benötigt werden. Danach war die Arbeit im Zelllabor für diesen Tag beendet. Danach unterzog mich meine Betreuerin Heidi einer kleinen Pipettierübung, welche zeigen sollte wie genau ich pipettieren kann. Dies kann man ganz einfach überprüfen, indem man in ein Gefäß, welches auf einer Waage steht, eine gewisse Menge an Flüssigkeit pipettiert. Ich musste jeweils 10 mal 1000 Mikroliter, 100 Mikroliter und 10 Mikroliter pipettieren. Danach wurde der Mittelwert der Gewichte ermittelt. Das Ergebnis war gar nicht schlecht. Danach haben wir ein Agrose Gel gegossen und die cDNA der HepG2-Tellen musste mit einem Laufpuffer vermischt werden und anschließend auf das zuvor gegossene DNA-Gel aufgetragen werden, um eine Agrose-Elektrophorese durchzuführen. Nach 30 min bei 90V wird das Gel unter einer UV-Lampe betrachtet. Als ich die Proben auf das Gel auftragen durfte, habe ich gesehen was eine ruhige Hand ist. Insgesamt mussten 14 Proben aufgetragen werden. 12 Proben der cDNA von Makrophagen (versehen mit unterschiedlichen Liganten und Kontrollen). Jede Probe war einmal 1:10 und einmal 1:100 verdünnt. Bei den anderen 12 Proben handelte es sich um ein Kontrollgen, ebenfalls mit den selben Liganten versehen. Unser Kontrollgen war das Hauskippinggen. Danach hat mir Heidi noch gezeigt wie man mit Hilfe diverser Computerprogramme die richtigen Primer für seine PCR sucht und wir haben auch zwei Primer für unsere RAW- und J774-ZEllen bestellt. Das war es dann auch schon für den Montag.

DIENSTAG

Auch der Dienstag morgen begann im Zelllabor. Heute mussten die RAW- und J774-Zellen mit aggregiertem LDL beladen werden. Dazu musste das Medium wieder abgesaugt werden. Danach werden die Zellen mit PBS gewaschen, das PBS wird danach abgesaugt. Danach werden 2 ml LPDS-Medium in die Flächen der Kontrollen und in die Flächen von 2 der 4 Sechserplatten pipettiert. In die beiden anderen Sechserplatten werden 2 ml an LPDS-Medium gemischt mit agg. LDL pipettiert. Für 8 Flächen werden 32ml LPDS-Medium mit 340 Mikroliter agg. LDL gemischt. Die Arbeit im Zelllabor war dann wieder vorbei. Danach wurde mit den weiteren 12 Proben der HepG2-Zellen eine Elektrophorese durchgeführt. Vor einer solchen Elektrophorese muss natürlich die RNA der Zellen erst revers transkribiert werden und danach muss eine PCR durchgeführt werden. Danach wurden die 24 Proben der cDNA von Makrophagen analysiert. Das Ergebnis ließ jedoch ein wenig zu wünschen übrig. Aufschlüsse werden erst die Proben der RAW- und J774 Zellen zeigen. Dienstag war danach beendet.

MITTWOCH

Wie man schon erraten kann, begann auch der Mittwoch morgen im Zelllabor. Heute mussten die RAW- und J774-Zellen mit den Liganten DMHCA (gelöst in EtOH) und TO (gelöst in DMSO) beladen werden. Es werden unterschiedliche Mengen an Liganten dazugegeben. Einmal 1 Mikroliter und einmal 10 Mikroliter. Natürlich müssen die Kontrollen und zu den 1mikroM Proben zusätzlich noch mit einer weiteren Menge an Lösungsmittel (EtOh oder DMSO) versehen werden, um für alle Zellen die selben Bedingungen zu schaffen. Danach musste noch eine weitere Zellkultur an RAW-Zelln (9 Flaschen) gewaschen und mit neuem Medium versehen werden. An den Proben, welche in den letzten beiden Tagen für die Elektrophorese genommen worden wurden, wurde 40 Zyklen der PCR durchgeführt. Heute werden Proben (35 Zyklen) auf das DNA Gel aufgetragen und eine Elektrophorese durchgeführt. (24 Proben cDNA Makrophagen und 24 Proben Hauskippinggen).

DONNERSTAG

Die erste Aufgabe bestand darin alle neun Flaschen der gestrig gewaschenen RAW-Zellkultur mit DMHCA zu beladen. Das alte Medium wird wieder abgesaugt und die Zellen werden wieder mit PBS gewaschen. Danach werden 5ml LPDS Medium in jede Flasche pipettiert. Für alle neun Flaschen müssen 45 ml LPDS Medium mit 45 Mikrolitern DMHCA (gelöst in EtOH) gemischt werden. Danach kommen jeweils 5 ml dieser Mischung i jede Flasche. Danach widmeten wir uns einer weiteren Zellkultur. THPC sind humane Zellen. Die bereits gesplitteten THPC1-Zellen werden gleich wie die RAW- und J774-Zellen mit den Liganten DMHCA und TO beladen. Der einzige Unterschied liegt darin, dass sich THPC1 nicht so wie RAW- und J774-Zellen am Boden der Flaschen absetzen, sie schwimmen frei im Medium. Man benötigt eine Reagenz, welche die Zellen zum Absinken zwingt. Aufgrund dieser Tatsache kann man das alte Medium nicht einfach so absaugen. Man muss prinzipiell mit dieser Zellkultur sehr vorsichtig sein. Danach wurden die J774- und RAW-Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff (gelöst in PBS 1:1000) beladen und so eine Minute in den Inkubator gestellt. Danach wurden die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop fotografiert. Die Fotos sollten einfach den Lipidanteil in den Zellen zeigen und somit auch eine Hilfe bei der Wirkungsfindung der Liganten sein. (Die Lipide fluoreszieren im blauen Licht rot)

FREITAG

Der letzte Tag dieser Woche begann ebenfalls im Zelllabor.
Zuerst wurde mit den 9 Flasche RAW Zellen eine
Chromatin-Immuno-Präparation. (Vorschrift folgt) Danach wurden die THPC1 geerntet. Durch eine bestimmte Reagenz haben sich Die THPC1-Zellen am Gefäßboden abgelagert. Durch Zugabe eines Lysispuffers gemischt mit Mercapoethanol lösen sich die Zellen und können runtergescrappt werden. Danach wurden die Proben eingefroren. Danach wurden ältere Zellen wieder gesplittet. Die RAW- und J774-Zellen wurden 1:6 gesplittet und die THPC wurden 1:3 gesplittet. Das Highlight des Tages bestand darin eine PCR anzusetzten.

PCR:

4 Mikroliter MgCl2
5 Mikroliter 10xBuffer
1 Mikroliter dNTP
2 Mikroliter fwd. Primer
2 Mikroliter rev. Primer
0,3 Mikroliter Hotfire
34,7 Mikroliter Wasser
49 Mikroliter

Danach werden die Proben in die PCR-Maschine gegeben und dort durchlaufen sie ein gespeichertes Pogramm. Nach 30 Zyklen werden 12 Mikroliter entnommen, danach folgen weitere 5 Zyklen danach werden wieder 12 Mikroliter entnommen und es folgen die letzten 5 Zyklen und es werden am Ende wieder 12 Mikroliter entnommen. Der Primer für die HepG2 Zellen war hSCREP. Für das Hauskippinggen wird GPDH als Primer verwendet.


Somit war auch die zweite Woche viel zu schnell vorüber. Ich freue mich schon wieder auf morgen. Jedoch ist nach dieser Woche das Praktikum auch schon wieder zu ende und das ist doch irgendwie sehr schade. Die Arbeit im Labor macht mir einfach sehr viel Spaß und jetzt fängt man sich auch schon an den Tagesablauf und die Arbeit zu gewöhnen. Der nächste Bericht folgt in einer Woche.