Heute Moregen habe ich mit der Voebereitung für die Elektrophorese begonnen.

Als erstes wurde das Proteinpulver, gewonnen aus LDL aus dem Eidotter zu je 5 mikrogramm in 2 Eprovetten eingewogen.
In jede Eprovette pipettierte ich dann 230mikroliter TBST-Buffer (zum Lösen der Proteine) und in jedes noch 100 ml entweder reduzierenden oder nicht reduzierenden Buffer.
Was in diesem Zusammenhang "reduzierend" bedeutet, habe ich bereits im blog beschrieben.

Während die Epprovette mit dem reduziernden Buffer für 5 min. in den Inkubator kam baute ich das Plastikgestell auf, in das die Gelplatten für die Elektrophorese gesteckt wurden. Dieser Behälter wurde dann mit einem spannungsleitenden Buffer aufgefüllt.
In jede der 8 Vertiefungen (slots) der Gelplatten kamen 7-14 mikroliter Probe. Während diese das Sammelgel durchliefen, betrug die elektrische Spannung 80 Volt, beim Trenngel wurde diese auf 180 erhöht.

für die Elektrophorese morgen

weiter mit der Immunoprecipitation.

Schon gestern Abend wurden die 2 Membranen mit den enthaltenen Proteinen wurde in je 7 Streifen geschnitten und über Nacht mit dem ersten Antikörper inubiert.
Dabei wurden die Streifen in einen Plastikbehälter gelegt, in dem jeder Streifen einzeln in einer Kammer aufbewahrt wurde.

Am nächsten Morgen stand dann (wieder einmal) das Waschen an. Flüssigkeit entfernen, durch TBST (=Waschbuffer) entfernen und auf den Shaker stellen, 3x für je 10 Minuten.

Dann pipettierte ich auf jeden Streifen 1 ml des 2. Antikörpers in Milchlösung. Danach wieder Shaker für eine Stunde.

Wieder waschen, wie schon zuvor.

27. August
Eine neue Methode.
Diese Methode dient zur Feststelung von Reaktionen zwischen verschiedenen Proteinen.

Dabei werde ich mich wieder primär mit dem Protein human AV beschäftigen.
Der Reaktionspartner wird hier der humane Rezeptor für dieses Protein sein, enthalten in Hautfibrioplasten (BUD 8).
Zu manchen Proben werden auch "beads" zugesetzt, vergleichbar mit kleinen Kugeln fördern sie die Komplexbildung.
Auch STS wird zugesetzt, dieser Stoff fördert die negative Ladung und beschleunigt so die Elektrophorese.

Nach dem Zusammenpipettieren der Stoffe werden sie wieder automatisch gemischt, je zwischen 1 und 3 x 3 h.


28.August
Heute, also am nächsten Tag , habe ich damit begonnen die Proben vom Rotor aus dem Kühlraum zu holen, wo sie über Nacht gerührt wurden um die Komplexbildung mithilfe der beads zu fördern.
Nun stand das Waschen der Proben an.
Zuerst wurden die Epprovetten kurz zentrifugiert, damit sich am Rand ein Pellet, bestehend aus den komplexierten Stoffen, bildet.
Dann wurde die restliche Flüssigkeit herauspipettiert und durch einen Waschpuffer (PBS) ersetzt.
Wieder in die Zentrifuge... 3 mal denselben Vorgang.

Dann wurde die gereinigte Probe mit einem Färbebuffer versetzt um sie für die Elektrophorese vorzubereiten.
Hier kamen die Gelplatten zur Anwendung, die von mir am vorigen Tag gegossen worden sind, diese wurden in ein Kunststoffbecken gespannt und dieses mit Buffer aufgegossen.
Dann pipettierte ich je 20 mikroliter Probe in die Geltaschen, das Becken wurde dann unter 80 Volt Spannung gesetzt.
Dadurch werden die Proben durch das Acrylatgel gezogen, im Sammelgel (oben) fließen die Proben noch auf selber Höhe um einen gemeinsamen Ausgangspunkt zu erhalten.
Im Trenngel (unten) bleiben dann die Proteine je nach Dichte (angegeben in kDalton) hängen:
Wenn die Proben die beiden Gels durchlaufen haben, werden dann die Glasplatten auseinandergenommen und das Gel mit den enthaltenen Proteinen auf eine Nitrocellulosemembran gelegt.
Diese wird mit einigen feuchten Papiertüchern in ein Gerät gelegt, mit dem wieder eine Spannung von 400mA angegelegt wird.
Das Gel und die Membran befinden sich senkrecht zur Fließrichtung der Proteine, also werden die Proteine vom Acrylatgel auf die N-Cell.-Membran überschrieben, folgend dem selben Prinzip wie schon zuvor. Dauer ca. 1,5 Stunden.
Diesen Vorgang nennt man semi-dry-blotting, weil das Gel nicht vollständig mit Wasser umgeben wird, sondern nur mit feuchten Papiertüchern.

Danach haben sich die Proteine, ihrer negativen Ladung folgend zum positiven Pol wandernd, vollständig vom Gel auf die Membran übertragen. Das Gel ist nun Abfall, weitergearbeitet wird mit der Nitrocellulose-Membran allein.

-> wie schon beschrieben.

Dieses Gel wird dann für das western blotting mit den Proteinen aus dem yolk-LDL (Eidotter) verwendet.

Delipidisierung:
Um das Protein von den Lipiden zu trennen, wird die Eprovette mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol aufgefüllt; in der Flüssigkeit lösen sich die Fette. Für diesen Vorgang wird die Mischung eine Stunde bei 4 grad C geschüttelt (selbstverständlich automatisch :-))
Die Flüssigkeit wird dann durch Zentrifugieren entfernt.

Weiter damit morgen.

Nach dem Versetzen mit LDL-Buffer wird die Lösung in einer Vakuumzentrifuge getrocknet.
Dabei entsteht ein pulvriger Rückstand, das ist festes LDL, eine Mischung aus Lipiden (Fetten) und Proteinen.
Wir brauchen für die weitere Arbeit nur die Proteine, deshalb werden die Lipide auf chemischem Weg entfernt.
Mit diesen isolierten Proteinen (darunter auch apoAV) kann dann zu Beispiel eine Elektrophorese durchgeführt werden.
Darüber werde ich auch noch berichten.
schönes Wochenende, Peter

Die Elektrophorese ist eine Analysemethode zur Bestimmung der Existenz verschiedener Stoffe in einem Gemisch, DNA oder wie in meinem Experiment Lipoproteine (apo A V).

Die Methode funktioniert so, dass in einem elektrischen Feld die Stoffe aufgrund ihrer Ladung durch ein Gel gezogen werden und sich nach ihrer Dichte auftrennen.

Das von mir durchgeführte Experiment ist ein Ligandenblot, d.h., Komplexe werden gebildet und nachgewiesen

Hier gibt es wieder 2 verschiedene Methoden.
Die Erste verwendet ein Gel mit Algenextrakt (agarose, auch in Lebensmitteln) als Geliermittel in waagrechten, die andere Methode hat ein Acrylat (Kunststoff) - Gel zwischen 2 dünnen Glasplatten. Diese werden zuerst senkrecht in eine Halterung gesteckt und dann mit dem Gel aufgefüllt.

Es gibt 2 verschiedene Gelarten: das Sammelgel, in ihm laufen die Proben gleich schnell, damit sie eine gemeinsame Lauffront erreichen und das Trenngel, wo sich die Proteine dann auftrennen.
Der Plastikkamm, durch den die Geltaschen, in die die Proben pipettiert werden, entstehen wird nach dem gießen der Gele in die Formen in das Sammelgel gesteckt.

Die so gebauten Formen kommen nun in einen Plastikbehälter mit Pufferlösung an den die elektrische Spannung angelegt wird.
Zuvor wird noch, der eigentlich wichtigste Teil des gesamten Aufbaus, die Proben zu je 16 mikroliter in die Geltaschen pipettiert.

Nach ungefähr einer Stunde haben die Proben dann das Gel durchflossen, und das so markierte Gel kann aus dem Pufferbecken entfernt werden.
Nun wird das glitschige und extrem zerbrechliche Gel auf eine Nitrocellulose-Membran gelegt. Durch eine zweite Elektophorese wird der Abdruck, den die Proben hinterlassen haben, vom Gel auf die Membran kopiert.

Mit dieser Membran werde ich nun weiterarbeiten.
Die beiden entstandenen Blätter werden in je 7 Streifen zerschnitten, an denen die Wirkung von verschiedenen Stoffen auf die Probe erprobt wird.

Je 7 Proben sind dabei reduzierend und nicht reduzierend.
"Reduzierend" bedeutet, dass die versponnenen Eiweißfäden durch Chemikalien "geradegebogen" werden, die "nicht reduzierenden" Proben hingegen bleiben im Ausgangszustand.

Die Streifen werden einzeln in einen Plastikbehälter gelegt und über nacht in einer Lösung aus vollkommen normaler Trockenmilch über Nacht auf einem Shaker (Rührmaschine) im Kühlraum gerührt.

Heute Morgen habe ich als erstes die Proben gewaschen, was bedeutet, dass ich für jeden Papierstreifen die Milchlösung durch CaCO2 - Lösung ersetze. Das 4 mal und dazwischen immer 20 Minuten auf dem Shaker.

Danach werde ich dann die Antikörper auf die Membranstreifen mit den Proben auftragen.
Danach werden die Streifen in einen Rahmen gelegt und mit einer enzymhaltigen Flüssigkeit befeuchtet.
Durch dieses Enzym beginnen die (falls gebildeten) Komplexe zu leuchten, bloß sehr schwach, aber stark genug um einen Film zu belichten.

Weiter gehts in der Dunkelkammer.
In den Rahmen wird ein Stück Film eingelegt, beim ersten Versuch mit einer Minute Belichtungszeit.
Dieser Film wird dann in der automatischen Entwicklungsmaschine mit Entwickler und Fixierflüssigkeit behandelt.
Jetzt, endlich, kann man das Resultat von Tagen sehen: Auf dem Film kann man dunkle Balken erkennen, mehr oder weniger stark und auf verschiedenen Höhen. Dadurch kann auf die Reaktionen geschlossen werden, denn: Reaktion=Licht=Balken.