Petra's Blog

15. und letzter Tag

petra.wiesinger — 2009-08-07T15:07:22Z

Heute war mein letzter Tag. Am Vormittag hab ich eigentlich nix gemacht und am Nachmittag mit Josef bzw. ohne also alleine gemessen. Es hat ganz gut funktioniert.
Der Abschied war dann doch etwas wehmütig, weil es mir doch gut gefallen hat, aber ich freue mich jetzt schon auf Litschau.

-ENDE-

14. Tag

petra.wiesinger — 2009-08-06T15:55:23Z

Heute war ich bei Verena. Sie hat eigentlich dasselbe Experiment wie letzten Mittwoch gemacht, nur dieses Mal bei 37°C (letztes Mal bei 24°C). (Mit TIRF und toccsl)
Allerdings gab es zuerst ein paar Probleme, denn das Bodipy war viel dichter und mobiler, deswegen würde es schwer werden bei der Auswertung Colloquosationen festzustellen. Trotzdem kann man die Stoichiometrie und die Mobilität auswerten.
Und dann haben wir als Kontrolle, wie viele Nanometer ein Signal vom roten zum blauen Frabkanal abweicht, Beads gemessen. Diese Messung habe ich dann auch noch ausgewertet (mittels catchME).
Heute fällt es mir wirklich schwer zu glauben, dass ab morgen schon wieder alles vorbei ist. Denn jetzt ist man drinnen, man hat den Rhythmus vom Messen, weiß wies geht, worauf man schauen muss (ungefähr zumindest ;) usw.

13. Tag

petra.wiesinger — 2009-08-06T15:49:42Z

Zuerst gab es in der Früh eine schlechte Nachricht. Tina ist krank geworden. Mittelohrentzündung. Sommit muss ich wohl die letzten drei Tage allein durchstehen.
Die zweite schlechte Nachricht an dem Tag war, dass im Setup (dreier) ein undefinierbares Teil drinnen war, Mario es rausgetan hat und es sich als Linse herausgestellt hat. Somit war dann das Set up ziemlich dejustiert. Jarek hat es dann so weit justiert, dass wir (Birgit+ich) unsere Messungen durchführen konnten. Das Spezielle am 3er-Set-up ist, dass man scannen kann. Somit hab ich dann die Proben vom Vortag, also die Bilayer mit und ohne Pattern gescannt (sogar ganz alleine). Bei der neuen Probe hab ich mir dann Hilfe holen müssen zum fokusieren, weil dazu braucht man schon etwas Übung und die hab ich noch nicht. Aber Clemens hatte sie ;)
Dann am Nachmittag hab ich angefangen, die Daten vom Dienstag auszuwerten, auch alleine. Es hat zwar funktioniert, aber die Resultate waren nicht die Besten...
Der Tag war also okay, aber ich habe schon gemerkt, dass es vor allem am Anfang hilft, wenn man zu zweit ist, auch wenn der/die andere auch erst am Anfang steht.

12. Tag

petra.wiesinger — 2009-08-04T20:52:54Z

Heute stellten wir - ziemlich alleine sogar - éinen Bilayer her. Und zwar so:
1. das Lipid DOPC wird in 1/3 Methanol und 2/3 Chlorophorm gelöst
2. die Lösungsmittel werden mit Stickstoff abgedampft
3. die Lipide werden in 200µl PBS Puffer gelöst
4. dann werden sie ins Ultraschallbad gegeben, damit sich Vesikel bilden, je länger sie im Bad sind, desto größer werden die Vesikel (die Lipide müssen "hüpfen" sonst bringt das bad nichts) für ca. 15 min
5. einstweilen richtet man die Kammern mit den Stempeln her
6. und man verdünnt die Farbstoffe, bei uns einmal das PGPE Alexa 647 (Oxlipid) 1:1000 und 1:100000 (rot), und das Bodipy DHPE 1:100000 und 1:1000000 (blau)
7. man gibt den Bilayer, nachdem er klar geworden ist, in die Kammern
8. ca. 15 min warten weil sich der Bilayer formieren muss
9. waschen mit Puffer
10. man gibt jeweils 10 µl der Marker drauf
11. man wartet ca. 15 min
12. nochmals waschen
dann kann man die kammern (mit Stempel und Bilayer drauf) ins Mikroskop geben
Wir wollten wissen, welche Diffusionsgeschwindigkeiten die Lipide haben und ob sie sich verändert. Mit dem blauen laser habenw ir leider keine guten Signale bekommen, mit dem roten aber schon und jetzt bin ich gespannt was herauskommt bei der Auswertung.

11. Tag

petra.wiesinger — 2009-08-03T17:30:08Z

Heute haben wir wieder mit bzw. für den Mario ausgewertet. Es ist zwar endlose Computerarbeit und Clickerei, aber da wir ja zu zweit sind, wars ganz okay, weil so konnten wir ein bisschen tractschen ;) Und bei der Auswertung ist auch noch etwas herausgekommen. Bei der Messung vom letzten Montag sind sogar einige Prozent Trimere und Tetramere herausgekommen. Das ist sehr super, denn die Wahrscheinlichkeit, dass zwei oder sogar drei oder vier Moleküle sich genau an derselben Stelle aufhalten, ist sehr klein. Das geht eben nur, wenn sie in Rafts in Verbindung stehen. Bei den anderen zwei Messungen passte der erste Fit nicht, so mussten´wir das Monomersignal nochmals neu bestimmen und zwar durch neues klicken.
Dann haben wir herausbekommen, dass ohne Cholesterol in der Zelle keine Tri- und Tetramere sind, mit aber schon. Dimere finden sich in beiden Messungen, das kann daran liegen, dass die Konzentration des Enzyms zu klein war und somit nicht das ganze Cholesterol zersetzt wurde und so durch den Entzug nur die größeren Strukturen aufgelöst wurden.
Also war es alles in allem ein erfolgreicher Tag.

10. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-31T15:11:47Z

Am Vormittag heute waren wir wieder beim Michi. Gestern war sein Überthema ja "cell to cell variation". Heute ging es mehr darum ob Zellen, die einander näher sind, z.B. in Zellhaufen oder Mutter- und Tochterzelle, "gleicher" bzw. weiter voneinander entfernte Zellen unterschiedlicher. Dazu schauten wir uns von jeweils einem Haufen drei nebeneinanderliegende Zellen an und dann vom nächsten Haufen wieder drei. So kann man beide Fragen mit einer Messung beantworten.
Am Nachmittag schauten wir dann mit Birgit, ob die Spitzen, die wir am Dienstag hergerichtet haben, noch intakt sind. Außerdem machten wir ein Kontrollexperiment mittels Scan, ob sich überhaupt ein Bilayer gebildet hat.
Zu unserem Leidwesen haben wir heut alle festgestellt, dass schon wieder unsere zweite Woche vorbei ist. Somit bleibt uns nur noch eine Woche, so richtig zum Freak zu werden :)

9. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-31T14:57:28Z

Heute beim Michi wollten wir wissen, ob es auf einer Zelle bestimmte Struktutren bzw. Sektionen gibt, wo die Proteine (bei uns das freidiffundierende Protein CD 147) schneller bzw. langsamer (durch)diffundieren. In weiterer Folge würde sich dann auch die Frage stellen welche Strukturen das veranlassen, das könnten z.B. Rafts sein. Das interessiert Michi aber zur Zeit noch nicht, weil er natürlich erst beweisen muss, dass es überhaupt Unterschiede gibt.
Sehen kann man das daran, wenn sich proteine an einem Ort länger aufhalten und erst dann weiterziehen. Das weist auf unterschiedliche Membranstrukturen hin.
Der Marker dabei war das Alexa 555, bei dem der Vorteil ist, dass es nur sehr langsam bleicht.

8. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-29T17:23:01Z

Bei Verena's Experiment ging es darum herauszufinden welche Proteine in bzw. auf einem Raft sind. Dazu wurden humane ICV/T24-Zellen (Endothelzellen) mit zwei verschiedenen Markern versehen. Der eine war ein Lipidanker namens CD59, an das ein Antikörper mit dem Farbstoff angehängt ist, der mit dem roten laser engeregt wird. Von diesem CD59 ist man sich ziemlich sicher, dass es ein Raft-Protein ist. Der zweite war das Lipid Bodypie GM1, wobei Bodypie das Fluroflor ist und GM1 das Lipid. Das Bodypie hängt dabei am GM1 dran und baut sich dadurch in die Zellmembran ein (im Gegensatz zum GFP, das sich in das Genom einbaut). Bei dem Bodypie GM1 ist es eben noch nicht gesichert, ob es ein Raft-Protein ist, deshalb sucht Verena nach Collocationen.
Das Lipid GM1 besitzt jeder Mensch und spielt z.B. eine Rolle bei Cholera, da das GM1 verursacht, dass man sehr viel Wasser ausscheidet und das führt dann zum Durchfall.
Normal sind Lipide nur einige wenige Nanometer groß und normal kann man Partikel, die kleiner als die Wellenlänge des Mikroskops sind nicht abbilden bzw. auflösen. Bei den Mikroskopen in der UNI beträgt die maximale Auflösung ca. 200-300 nm. Bei allen Signalen kleiner als diese Größe sind keine (Weg-)Differenzen mehr zu sehen und die Signale schmieren aus. Durch einen mathematischen Prozess, nämlich eine Punktlichtquelle als Gauß-Funktion zu betrachten, kenn man einzelne Signale identifizieren und lokalisieren.
Außerdem hat uns Stefan erzählt, was er schon so alles gemacht hat. Unter anderem hat er die Nanotubes untersucht. Das sind die Kanäle, mit denen sihc zwei Zellen verbinden. er hat entdeckt wie groß sie sind, wie die Mobilität der Proteine in ihnen ist, dass sie nicht nur zwischen Tochterzellen bestehen, aber auch nicht zwischen allen und auch auf ziemlich große Distanzen. Wie und warum sie nicht zwischen allen Verbindungen aufbauen, ist noch ein Rätsel.
Und zusätslich bekamen wir heute noch von Clemens eine ausführliche Erklärung wie ein Mikroskop funktioniert...

7. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-28T15:32:33Z

Am Vormittag haben wir wieder die Daten von Marios und unserer Messung gestern ausgewertet. Es ist auch was dabei herausgekommen, aber grad wie wir darüber diskutieren wollten, hat uns Birgit geholt um ihr zu helfen. Bei ihr haben wir einen Bilayer hergestellt. Dazu werden Lipide in Methanol und Formaldehyd gelöst und dann wird Stickstoff dazugegeben, dass das Methanol und das Formaldehyd verdunsten. Somit bleiben die Lipide an der Gefäßwand hängen wie ein milchiger Film. Das haben Lukas und Birgit schon gestern gemacht. Heute ging's dann weiter, indem man die Lipide mit einem PBS-Puffer löste und dann in ein Ultraschallbad gab, damit sich die Bilayer bilden. Der Moment, da sich der Bilayer gebildet hat, ist da, wenn die Flüssigkeit durchsichtig wird. Dann muss man warten und den Bilayer waschen, damit auch nur eine Schicht am Glasplättchen haften bleibt und wir nicht viele Schichten übereinander haben.
Nachher haben wir dann noch bei Clemens zugeschaut, wie er das Set-up eingestellt hat und festgestellt, dass sich da ganz andere Zeitrechnungen auftun. Denn es kann schon mal ein paar Wochen oder Monate dauern, bis etwas wirklich gut funktioniert bzw. man weiß wieso etwas nicht funktioniert. Gesehen haben wir leider bei Clemens noch nicht so viel, aber wieso war uns allen, auch Clemens, noch ein Rätsel....

6. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-27T16:20:54Z

Am Vormittag haben wir heute Mario beim Auswerten der Messungen vom Mittwoch geholfen. Am Nachmittag haben wir dann wieder gemessen, dieses Mal aber nicht, obe sich die rafts ohne Cholesterol auflösen, sondern einfach als Kontrollexperiment, ob es die Rafts überhaupt gibt.
Wie wir gemessen haben und ob sich dadurch eine gute Statistik ergibt, wissen wir noch nicht, aber heute über Nacht läuft das Programm zum Auswerten und morgen wissen wir dann hoffentlich schon mehr.

5. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-24T16:37:08Z

Heute war es daran, die Daten, die wir am Dienstag mit Josef gesammelt hatten, auszuwerten. Das ist viel Arbeit am Computer und gutes Fingertraining. Die nötigen programme dazu waren Gott sei Dank schon geschrieben worden, aber immer wieder kam eine Meldung mit Error. Das Auswerten war teilweise ganz spannend, aber auch nicht unbedingt motivierend, weil die Daten zum Teil nicht schön genug waren - zu viel Hintergrund, nicht scharf genug, zu hohe Dichte...- und zum anderen Ergebnisse herausgekommen sind, die wir nicht erwartet hätten. So ergab das Ergebnis für Tetramere 0%, was Josefs Theorie, dass die Kanäle auch im Ruhezustand aus 4 Einheiten gebildet sind, eindeutig entgegenspricht. Und obwohl er schon ziemlich lange an diesen Kanälen forscht, braucht er noch große Mengen von Daten um Aussagen tätigen zu können.
Besonders deprimierend ist es dann, wenn man, z.B. so wie wir in der Nature, liest bzw. sich anschaut, dass andere mehr Erfolg haben, wenn auch sich die Zielsetzung und die Methoden etwas unterscheiden.
Also alles in allem zwar ein interessanter, aber nicht sehr motivierender Tag.

PS: Inzwischen fühle ich mich schon besser, ich freue mich schon wirklich immer zur Uni zu gehen und ich habe nicht mehr den Eindruck, als würden wir die anderen bei ihrer Arbeit stören.

4. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-24T16:28:17Z

Heute haben wir leider erleben müssen, wie ein Tag für einen Wissenschaftler deprimierend sein kann. Bei Julians Leberkrebszellen sollte man eigentlich Droplets sehen. Das sind eine Art Tropfen, die viel Fett aufnehmen können, und auf dennen es Proteine gibt, die diffundieren. Wir wollten zwei verschiedene Proteine untersuchen und herausfinden, ob sie unterschiedlich schnell diffundieren.
Probleme, die dabei auftraten, waren, dass vor dem bleichen schon zu wenig fluoreszierende Teile da waren, so dass nachher fast nichts mehr diffundierte. So war es extrem schwierig passende zellen zu finden. Außerdem sollten sicn die Droplets eher am Rand der Zelle aufhalten und eher einzeln. Heute aber haben sie sich alle in Grüppchen in der Mitte versammelt.
Die Untersuchung wäre z.B. wichtig für Hepatitis C. Denn die Viren brauchen bestimmte proteine zum Andocken, damit sie sich replizieren können. Wenn man die Proteine verlangsamen könnte, hätte man so vielleicht ein Medikament gegen Hepatitis C entdeckt.
Dann haben wir noch DNA extrahiert und sie durch ein Agarosegel laufen lassen, um zu sehen, ob auch wirklich welche drinnen ist. Und weil es ja so ein toller Tag war, war grad in den zwei Proben, die Julian am dringendstel begraucht hätte keine DNA drinnen.
Resumee: Echt toller Tag!

3. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-22T14:22:19Z

Heute gings darum, ob die lipid rafts auch weiterhin bestehen, wenn man das Cholesterol einer zelle (in unserem Fall T-Zelle) entfernt oder chemisch umwandelt. Bei uns wurde das Cholesterol umgewandelt, weil wenn man es ganz entfernen würde, würde die ganze Zelle absterben, weil fast alle ihre Bestandteile es brauchen um zu überleben. Leider waren die Zellen heute nicht wirklich groß und auch teilweise nicht schön, sodass man lange suchen musste bis man wieder eine geeignete Zelle gefunden hat. Und weil heute so ein schöner Tag ist und die Zellen nicht mitgespielt haben, haben wir heut ein bisschen früher aufgehört....

2. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-21T16:27:09Z

Heute waren wir bei Josef im Labor. Er untersucht den Calciumkanal ORAI 1 oder CRAC bzw. aus wie vielen Untereinheiten ein solcher Kanal besteht. Man ist sich sicher, dass er in Aktion aus 4 Einheiten besteht, im Ruhezustand aber sind die Meinungen noch geteilt.
Dazu werden die Einheiten der Calciumkanäle mit GFP markiert und dann unter dem Mikroskop angeschaut. Da die Dichte der Einheiten zu groß ist, wird ein Teil einer Zelle (CHO-Zellen = Eierstockzellen vom chines. Hamster, humane Blasenkrebszelle) mit Hilfe eines starken, langen (600 ms) Laserstrahls gebleicht, weil die anderen Einheiten dann nachrücken und man so einzelne sehen kann. Es ist wichtig sie gut getrennt und genügend weit voneinander entfernt zu haben, weil man sonst die Intensität nicht messen kann. (TOCCSL - Thinning Out Clusters while Conserving the Stoichiometry of Labeling)
Die Schwierigkeit bei dieser Forschungsarbeit liegt nicht darin, feststellen zu können wie viele Einheiten es sind, sondern vielmehr welche Intensität eine Einheit hat. Denn ohne diesen Vergleich erübrigt sich die andere Frage.
Bei den Aufnahmen haben wir auch gesehen, dass einige Einheiten zuerst diffundieren, und dann aber an einer Stelle "hängen bleiben", sie werden immobil. Wieso und welche Folgen das hat, weiß man nicht. Es ist das erste Mal überhaupt, dass man so ein Verhalten erkennen konnte. Aus einer Arbeit entsteht also oft auch die nächste.
Die Arbeit von Josef ist auch für uns Menschen wichtig, weil der ORAI 1 eine wichtige Rolle in der Aktivierung der T-Zelle, also des Immunsystems, spielt.
Die Zellen, die wir verwendet haben, werden am Anfang gekauft und dann zu bis zu 20 Zelllinien gezüchtet. Sie sind zuerst im Brutkasten bei 37°C, werden dann herausgenommen, kühlen dabei auf ca. 22° Raumtemperatur ab, werden umgelagert, wobei sie von ihrem geliebten Nährstoffboden wegkommen und in Puffer gelegt werden, und kommen dann wieder auf 37° im Mikroskop zu liegen. Für Josef ziemlich erstaunlich, dass die Zellen so lange leben (auf die Frage warum schon einige tot waren=)

Der 1. Tag

petra.wiesinger — 2009-07-20T17:05:51Z

Heute, 20.07, war mein erster Tag an der JKU in der Biophysik. Als erstes durften wir gleich mal bei der Besprechung am Montag-Morgen dabei sein, die teilweise auf Englisch gesprochen wurde, da gerade ein Gast aus Ungarn in Linz ist. Das Problem des Verstehens war allerdings nicht die Sprache, sondern der Inhalt. Von all den Abkürzungen wurde einem schon fast schwindlig und man fragte sich, wie sollte man da in 3 Wochen jemals einen Einblick in das, für mich noch komplizierte, Thema der Ultrasensiblen Mikroskopie finden.
Dann wurden wir kurz im Labor herumgeführt und dann durften wir selbst ein Haar genauer unter die Lupe nehmen, mit allen möglichen Objektiven, die sehr teuer sind. Uns wurde aber versichert, dass sie uns nicht den Kopf abreißen würden,w enn wir eins kaputtmachen :) Das Haar zu Auge zu bekommen war gar nicht so leicht, da man den Abstand des Objektivs von der Probe genau einstellen muss. Auch muss natürlich das Objektiv genau unter der Probe liegen, was wirklich nicht einfach war zu steuern, obwohl es einen super Joy-Stick gibt. Aber die Linsen vom Objektiv waren wirklich schon sehr klein.
Zum Abschluss durften wir uns noch ein "unreines" Cholesterol (HDL) ansehen, verunreinigt durch irgendwelche Würmer. Und dann wurde auch noch geprüft ob Birgit es geschafft hatte eine Bilayer zu machen.
Alles in allem war es ein interessanter Tag, obwohl ich mich noch nicht 100% wohlfühle.