Heute war mein letzter Tag. Am Vormittag hab ich eigentlich nix gemacht und am Nachmittag mit Josef bzw. ohne also alleine gemessen. Es hat ganz gut funktioniert.
Der Abschied war dann doch etwas wehmütig, weil es mir doch gut gefallen hat, aber ich freue mich jetzt schon auf Litschau.

-ENDE-

Heute war ich bei Verena. Sie hat eigentlich dasselbe Experiment wie letzten Mittwoch gemacht, nur dieses Mal bei 37°C (letztes Mal bei 24°C). (Mit TIRF und toccsl)
Allerdings gab es zuerst ein paar Probleme, denn das Bodipy war viel dichter und mobiler, deswegen würde es schwer werden bei der Auswertung Colloquosationen festzustellen. Trotzdem kann man die Stoichiometrie und die Mobilität auswerten.
Und dann haben wir als Kontrolle, wie viele Nanometer ein Signal vom roten zum blauen Frabkanal abweicht, Beads gemessen. Diese Messung habe ich dann auch noch ausgewertet (mittels catchME).
Heute fällt es mir wirklich schwer zu glauben, dass ab morgen schon wieder alles vorbei ist. Denn jetzt ist man drinnen, man hat den Rhythmus vom Messen, weiß wies geht, worauf man schauen muss (ungefähr zumindest ;) usw.

Zuerst gab es in der Früh eine schlechte Nachricht. Tina ist krank geworden. Mittelohrentzündung. Sommit muss ich wohl die letzten drei Tage allein durchstehen.
Die zweite schlechte Nachricht an dem Tag war, dass im Setup (dreier) ein undefinierbares Teil drinnen war, Mario es rausgetan hat und es sich als Linse herausgestellt hat. Somit war dann das Set up ziemlich dejustiert. Jarek hat es dann so weit justiert, dass wir (Birgit+ich) unsere Messungen durchführen konnten. Das Spezielle am 3er-Set-up ist, dass man scannen kann. Somit hab ich dann die Proben vom Vortag, also die Bilayer mit und ohne Pattern gescannt (sogar ganz alleine). Bei der neuen Probe hab ich mir dann Hilfe holen müssen zum fokusieren, weil dazu braucht man schon etwas Übung und die hab ich noch nicht. Aber Clemens hatte sie ;)
Dann am Nachmittag hab ich angefangen, die Daten vom Dienstag auszuwerten, auch alleine. Es hat zwar funktioniert, aber die Resultate waren nicht die Besten...
Der Tag war also okay, aber ich habe schon gemerkt, dass es vor allem am Anfang hilft, wenn man zu zweit ist, auch wenn der/die andere auch erst am Anfang steht.

Heute stellten wir - ziemlich alleine sogar - éinen Bilayer her. Und zwar so:
1. das Lipid DOPC wird in 1/3 Methanol und 2/3 Chlorophorm gelöst
2. die Lösungsmittel werden mit Stickstoff abgedampft
3. die Lipide werden in 200µl PBS Puffer gelöst
4. dann werden sie ins Ultraschallbad gegeben, damit sich Vesikel bilden, je länger sie im Bad sind, desto größer werden die Vesikel (die Lipide müssen "hüpfen" sonst bringt das bad nichts) für ca. 15 min
5. einstweilen richtet man die Kammern mit den Stempeln her
6. und man verdünnt die Farbstoffe, bei uns einmal das PGPE Alexa 647 (Oxlipid) 1:1000 und 1:100000 (rot), und das Bodipy DHPE 1:100000 und 1:1000000 (blau)
7. man gibt den Bilayer, nachdem er klar geworden ist, in die Kammern
8. ca. 15 min warten weil sich der Bilayer formieren muss
9. waschen mit Puffer
10. man gibt jeweils 10 µl der Marker drauf
11. man wartet ca. 15 min
12. nochmals waschen
dann kann man die kammern (mit Stempel und Bilayer drauf) ins Mikroskop geben
Wir wollten wissen, welche Diffusionsgeschwindigkeiten die Lipide haben und ob sie sich verändert. Mit dem blauen laser habenw ir leider keine guten Signale bekommen, mit dem roten aber schon und jetzt bin ich gespannt was herauskommt bei der Auswertung.

Heute haben wir wieder mit bzw. für den Mario ausgewertet. Es ist zwar endlose Computerarbeit und Clickerei, aber da wir ja zu zweit sind, wars ganz okay, weil so konnten wir ein bisschen tractschen ;) Und bei der Auswertung ist auch noch etwas herausgekommen. Bei der Messung vom letzten Montag sind sogar einige Prozent Trimere und Tetramere herausgekommen. Das ist sehr super, denn die Wahrscheinlichkeit, dass zwei oder sogar drei oder vier Moleküle sich genau an derselben Stelle aufhalten, ist sehr klein. Das geht eben nur, wenn sie in Rafts in Verbindung stehen. Bei den anderen zwei Messungen passte der erste Fit nicht, so mussten´wir das Monomersignal nochmals neu bestimmen und zwar durch neues klicken.
Dann haben wir herausbekommen, dass ohne Cholesterol in der Zelle keine Tri- und Tetramere sind, mit aber schon. Dimere finden sich in beiden Messungen, das kann daran liegen, dass die Konzentration des Enzyms zu klein war und somit nicht das ganze Cholesterol zersetzt wurde und so durch den Entzug nur die größeren Strukturen aufgelöst wurden.
Also war es alles in allem ein erfolgreicher Tag.

Am Vormittag heute waren wir wieder beim Michi. Gestern war sein Überthema ja "cell to cell variation". Heute ging es mehr darum ob Zellen, die einander näher sind, z.B. in Zellhaufen oder Mutter- und Tochterzelle, "gleicher" bzw. weiter voneinander entfernte Zellen unterschiedlicher. Dazu schauten wir uns von jeweils einem Haufen drei nebeneinanderliegende Zellen an und dann vom nächsten Haufen wieder drei. So kann man beide Fragen mit einer Messung beantworten.
Am Nachmittag schauten wir dann mit Birgit, ob die Spitzen, die wir am Dienstag hergerichtet haben, noch intakt sind. Außerdem machten wir ein Kontrollexperiment mittels Scan, ob sich überhaupt ein Bilayer gebildet hat.
Zu unserem Leidwesen haben wir heut alle festgestellt, dass schon wieder unsere zweite Woche vorbei ist. Somit bleibt uns nur noch eine Woche, so richtig zum Freak zu werden :)

Heute beim Michi wollten wir wissen, ob es auf einer Zelle bestimmte Struktutren bzw. Sektionen gibt, wo die Proteine (bei uns das freidiffundierende Protein CD 147) schneller bzw. langsamer (durch)diffundieren. In weiterer Folge würde sich dann auch die Frage stellen welche Strukturen das veranlassen, das könnten z.B. Rafts sein. Das interessiert Michi aber zur Zeit noch nicht, weil er natürlich erst beweisen muss, dass es überhaupt Unterschiede gibt.
Sehen kann man das daran, wenn sich proteine an einem Ort länger aufhalten und erst dann weiterziehen. Das weist auf unterschiedliche Membranstrukturen hin.
Der Marker dabei war das Alexa 555, bei dem der Vorteil ist, dass es nur sehr langsam bleicht.

Bei Verena's Experiment ging es darum herauszufinden welche Proteine in bzw. auf einem Raft sind. Dazu wurden humane ICV/T24-Zellen (Endothelzellen) mit zwei verschiedenen Markern versehen. Der eine war ein Lipidanker namens CD59, an das ein Antikörper mit dem Farbstoff angehängt ist, der mit dem roten laser engeregt wird. Von diesem CD59 ist man sich ziemlich sicher, dass es ein Raft-Protein ist. Der zweite war das Lipid Bodypie GM1, wobei Bodypie das Fluroflor ist und GM1 das Lipid. Das Bodypie hängt dabei am GM1 dran und baut sich dadurch in die Zellmembran ein (im Gegensatz zum GFP, das sich in das Genom einbaut). Bei dem Bodypie GM1 ist es eben noch nicht gesichert, ob es ein Raft-Protein ist, deshalb sucht Verena nach Collocationen.
Das Lipid GM1 besitzt jeder Mensch und spielt z.B. eine Rolle bei Cholera, da das GM1 verursacht, dass man sehr viel Wasser ausscheidet und das führt dann zum Durchfall.
Normal sind Lipide nur einige wenige Nanometer groß und normal kann man Partikel, die kleiner als die Wellenlänge des Mikroskops sind nicht abbilden bzw. auflösen. Bei den Mikroskopen in der UNI beträgt die maximale Auflösung ca. 200-300 nm. Bei allen Signalen kleiner als diese Größe sind keine (Weg-)Differenzen mehr zu sehen und die Signale schmieren aus. Durch einen mathematischen Prozess, nämlich eine Punktlichtquelle als Gauß-Funktion zu betrachten, kenn man einzelne Signale identifizieren und lokalisieren.
Außerdem hat uns Stefan erzählt, was er schon so alles gemacht hat. Unter anderem hat er die Nanotubes untersucht. Das sind die Kanäle, mit denen sihc zwei Zellen verbinden. er hat entdeckt wie groß sie sind, wie die Mobilität der Proteine in ihnen ist, dass sie nicht nur zwischen Tochterzellen bestehen, aber auch nicht zwischen allen und auch auf ziemlich große Distanzen. Wie und warum sie nicht zwischen allen Verbindungen aufbauen, ist noch ein Rätsel.
Und zusätslich bekamen wir heute noch von Clemens eine ausführliche Erklärung wie ein Mikroskop funktioniert...

Am Vormittag haben wir wieder die Daten von Marios und unserer Messung gestern ausgewertet. Es ist auch was dabei herausgekommen, aber grad wie wir darüber diskutieren wollten, hat uns Birgit geholt um ihr zu helfen. Bei ihr haben wir einen Bilayer hergestellt. Dazu werden Lipide in Methanol und Formaldehyd gelöst und dann wird Stickstoff dazugegeben, dass das Methanol und das Formaldehyd verdunsten. Somit bleiben die Lipide an der Gefäßwand hängen wie ein milchiger Film. Das haben Lukas und Birgit schon gestern gemacht. Heute ging's dann weiter, indem man die Lipide mit einem PBS-Puffer löste und dann in ein Ultraschallbad gab, damit sich die Bilayer bilden. Der Moment, da sich der Bilayer gebildet hat, ist da, wenn die Flüssigkeit durchsichtig wird. Dann muss man warten und den Bilayer waschen, damit auch nur eine Schicht am Glasplättchen haften bleibt und wir nicht viele Schichten übereinander haben.
Nachher haben wir dann noch bei Clemens zugeschaut, wie er das Set-up eingestellt hat und festgestellt, dass sich da ganz andere Zeitrechnungen auftun. Denn es kann schon mal ein paar Wochen oder Monate dauern, bis etwas wirklich gut funktioniert bzw. man weiß wieso etwas nicht funktioniert. Gesehen haben wir leider bei Clemens noch nicht so viel, aber wieso war uns allen, auch Clemens, noch ein Rätsel....

Am Vormittag haben wir heute Mario beim Auswerten der Messungen vom Mittwoch geholfen. Am Nachmittag haben wir dann wieder gemessen, dieses Mal aber nicht, obe sich die rafts ohne Cholesterol auflösen, sondern einfach als Kontrollexperiment, ob es die Rafts überhaupt gibt.
Wie wir gemessen haben und ob sich dadurch eine gute Statistik ergibt, wissen wir noch nicht, aber heute über Nacht läuft das Programm zum Auswerten und morgen wissen wir dann hoffentlich schon mehr.