Die beiden letzten Tage verbrachte ich mit dem Sammeln von Infos für meinen Endbericht und Gesprächen über die Interpretation der Ergebnisse unseres Projektes.

Donnerstag, 14. Juli 2011
Heute stand ein sehr arbeitsintensiver Tag an. Denn wir nahmen mit allen entnommenen Teilen der Maus eine Paraffineinbettung vor. Im Prinzip war es der gleiche Vorgang, wie wir ihn am Dienstag schon durchführten. Nur diesmal hatten wir mehrere Gewebeproben.

Freitag, 15. Juli 2011
An diesem Tag beendeten wir die Paraffineinbettung mit unseren Gewebeproben der sezierten Mäuse. Danach bestaunten wir die eindrucksvollen Bilder einer Immunofluoreszenz Doppelfärbung, an der wir meist nur zusahen, da dieser Vorgang sehr komplex ist. Der Tag endete, nachdem wir Blutstriche unseres eigenen Blutes einfärbten und diese dann unter dem Mikroskop betrachteten. Uns gelang aber leider keine schöne Färbung, deshalb werden wir es kommende Woche nochmals versuchen.

Montag, 18. Juli 2011
Diese Woche begannen wir mit dem Isolieren der RNA aus Zellen. Am Nachmittag führten wir dann eine one-step RT-PCR durch.

Dienstag, 19. Juli 2011
Der Tag begann mit Recherchen für meinen Bericht und endete mit der Herstellung der Färbungen für unsere Gewebeschnitte.

Mittwoch, 20. Juli 2011
Nach ergiebigen Recherchen über das Endoplasmatische Retikulum und neuen Erkenntnissen über den ER-Stress, nahmen wir eine Immunofluoreszenz Doppelfärbung vor.

Donnerstag, 21. Juli 2011
Das Isolieren der RNA meiner Proben ging folgendermaßen vonstatten: Zuerst musste ich die Zellen mit 1 ml Tri Reagent RT resuspendieren, damit sie wärmeunempfindlicher wurden und ich sie dann in ein 1,5 ml Eppi überführen konnte. Daraufhin spülte ich 50 ml BAN ein und kippte die Eppis 20-mal, um alles gut zu vermischen. Nachdem die Proben 5 Minuten bei Raumtemperatur standen, legte ich sie für 15 Minuten bei 12000g und 4 Grad Celsius in die Zentrifuge. Danach überführte ich 500 Mikroliter des klaren Überstandes in ein neues Eppi und mischte ihn mit 500 Mikroliter Isopropanol. Nach 20 maligen Kippen und 10 Minuten Ruhe bei Raumtemperatur, folgte eine Zentrifugation für 8 Minuten bei 12000g und 4 Grad Celsius. Später wurde der Überstand abdekantiert und mit 1 ml 75%igen EtOH gewaschen. Dann zentrifugierte ich die Proben für 5 Minuten bei 7500g und 4 Grad Celsius und dekantierte den Überstand wieder ab. Schließlich musste ich die Eppis kurz bei 12000g abzentrifugieren und den restlichen EtOH mit der Pipette entfernen. Nach dem Überkopftrocknen für 3 Minuten, resuspendierte ich das Pellet mit 50 bis 100 Mikroliter (je nach Größe des Pellets) Rnase-freies Wasser und gab die Eppis für 10 Minuten bei 55 Grad Celsius und 300 rpm in den Thermoschüttler.
Zuletzt folgten nur noch die Vermessung am Nanodrop, und das Auftragen eines Gels für ein Foto, zum Nachweis, dass RNA vorhanden ist. Um die RNA am Nanodrop zu vermessen, pipettierte ich jeweils 2 Mikroliter meiner Proben auf den Spectrophotometer und dank der Software, brauchte ich nichts weiter zu tun, als auf „Messure“ zu klicken und bekam dann das Ergebnis. Im Großen und Ganzen lagen die Ergebnisse zwischen 70 Nanogramm pro Mikroliter, da diese probe nur ein Restbestand war, und ca. 310 Nanogramm pro Mikroliter.
Für ein Gelfoto, auf dem man die RNA nachweisen kann (man sieht sie als leuchtende Banden), brauchte ich nur 0,75 Gramm Agerose, welche ich dann mit TAE auf 50 ml verdünnte. Dieses Gemisch erhitzte ich dann so lange, bis keine Schlieren mehr zu sehen waren und fügte dann, sobald es abkühlte, 4 Mikroliter Ethidiumbromid hinzu. Nach kurzem Schwenken, goss ich das Gemisch in die kleine Gelform mit einem 12er-Kamm. Nach einer 40 Minuten Pause, in denen die Flüssigkeit sich verfestigt hat, trug ich die mit LoadingDye versetzten RNA-Proben auf und schloss sie bei 150 mV an Strom an. Nach weiteren 49 Minuten war es dann soweit: Mithilfe eines Gerätes fotografierten wir unser Gel unter UV-Licht und sahen leuchtende Banden.
Später führten wir noch eine Resorcin/Fuchsinfärbung und eine Orceinfärbung durch.

Freitag, 22. Juli 2011
Heute stand eine Reverse Transkriptase auf dem Programm. Dazu nahmen wir die schon gestern isolierte RNA und nach hinzugeben eines Mastermixes (der aus RT Buffer, dNTP Mix, Random Primer, Enzym und H2O bestand) zu jeder Probe, legten wir die Proben noch in den Thermocycler und nach ca. 135 Minuten erhielten wir die fertige cDNA.

Montag, 25. Juli 2011
Dieser sehr arbeitsintensive Tag begann mit einer H.E.-Färbung unseres geschnittenen und auf Objektträgern festgetrockneten Gewebes. Dazu legten wir sie zuerst in Xylen, dann in eine absteigende EtOH-Reihe, Aqua dest. und schließlich färbten wir die Zellkerne in Hämatoxylin. Danach folgten Spülvorgänge und Zwischenstopps in Ammonium- und Scottwasser. Vor der Eosinfärbung waren alle Gewebeschnitte noch on 80%igen EtOH. Es folgte nur noch Bäder in der aufsteigenden Alkoholreihe, ehe alle im Xylen verweilten und wir sie schlussendlich mit Histomount und Deckgläsern eincoverten.
Nun begann ich mit der eigentlichen Arbeit meines Projektes. Und zwar der RNA-Isolierung aus den 2008er Zellen, denen zwei Gruppen vorausgingen: Einer Kontrollgruppe und einer Polytoximanen Suchtgruppe. Es wurde zuerst das Blut vor und dann nach einem 90 Minütigen Stresstest abgenommen. Nach dem Vermessen folgte noch eine RT (Reverse Transkriptase) und eine qPCR. Damit war der Tag geschafft.

Dienstag, 26. Juli 2011
Nach einem sehr anstrengenden Tag folgt meist ein eher entspannter. Deshalb stand heute nur schneiden weiterer Gewebeblöcke und deren H.E.-Färbung auf dem Programm.

Mittwoch, 27. Juli 2011
Schön langsam kehrt der Alltag ein und ich isolierte weitere RNA aus den 2008er Proben und färbte wiederum meine Gewebeschnitte.

Donnerstag, 28. Juli 2011
Nach der morgendlichen PCR mit den 2008er Proben, recherchierte ich in der Bibliothek weiter für meine Arbeit und später machten wir sehr schöne und eindrucksvolle Fotos unter dem Mikroskop meiner gefärbten Gewebeschnitte.

Freitag, 29. Juli 2011
Heute habe ich die RNA vom gestrigen Tag noch vermessen und später führte ich eine Reverse Transkriptase zum ersten Mal ganz alleine durch. Dazu musste ich zunächst das Mischverhältnis zwischen RNA und H2O ausrechne, 1,5 ml Eppis beschriften, darin die ausgerechnete Menge an H2O vorlegen und die RNA der verschiedenen Proben auftragen. Nach erstellen eines Mastermixes (der aus RT Buffer, dNTP Mix, Random Primer, Enzym und H2O bestand) musste ich nur jeweils 10 Mikroliter der verdünnten RNA und 10 Mikroliter des Mastermixes in die beschrifteten 0,2 ml Eppis pipettieren und alle Proben in den Thermocycler stellen.

Montag, 1. August 2011
Meine letzte Woche begann mit dem Vermessen der RNA der letzten Proben und meiner ersten selbstständigen qPCR. Dazu vermischte ich 2 Mikroliter der cDNA vom Freitag und 23 Mikroliter des erstellten Mastermixes, der aus peqLab Mix und den fwd. und rev. Primern bestand. Schließlich gab ich alles noch in den Thermocycler.

Dienstag, 2. August 2011
Diesen Tag begann ich mit dem assistieren bei einer qPCR unserer 2008er Proben. Dann bekam ich ein paar sehr nützliche Infos für meine Abschlussarbeit und begann diese auch schon zu schreiben. Am Nachmittag analysierten wir die Ergebnisse der qPCR und wiederholten eine zuvor schiefgelaufene PCR.

Dieser Tag begann mit einlesen in Diplomarbeiten und weiteren Recherchen, ehe dann das Sezieren einer 4 Wochen alten Maus folgte. Dabei entnahmen wir Organe und anderes Gewebe und legten es in PFA ein.

Heute begannen wir mit einer PCR und dann folgte eine Paraffin Einbettung, welche wie folgt von statten ging: Wir legten unser Gewebe (eine Plazenta) für 45 min in 70%igen Alkohol, dann für 45 min in 95%igen, dann für 30 min wieder in 95%igen, dann für 30 min in 100%igen, dann für 10 min wieder in 100%igen. Danach legten wir es für jeweils 30 min in das Lösungsmittel Toluen. Später betteten wir es einmal in Paraffin #6 und #9 für jeweils 60 min ein. Zu guter Letzt gossen wir es noch in Wachs und kühlten es.

Nach ein paar Recherchen, was eigentlich genau die cDNA, oder wie der genaue Aufbau der RNA aussieht, begannen wir mit der Isolierung von Peripheren Mononukleären Zellen (PBMC). Dazu nehmen wir 8 ml Blut ab und verdünnten es 1:1 mit CMF PBS (Puffer) in einem 50 ml Röhrchen. Dann schichteten wir es auf das zytotoxische Histopaque. Nach dem Zentrifugieren bei 400g für 30 min, ohne Bremse, hoben wir mit einer sterilen Einmal-Pastteurpipette die Interphase ab, was zugegeben leichter klingt, als es ist. Danach überführten wir es wieder in ein 50 ml Röhrchen mit 30 ml CMF PBS und zentrifugierten es bei 400g für 10 min bei schwacher Bremse. Später gossen wir den Überstand ab und resuspendierten das Zellpellet mit 1 ml CMF PBS, füllten es anschließend wieder mit 30 ml CMF PBS auf, zentrifugierten es wieder unter gleichen Bedingungen und wiederholten den Vorgang nochmals, bis wir schließlich die Zellzahlmessung am CASY vornahmen. Bestes Ergebnis waren ca. 9,57*10^7 Zellen.