Holá liebe Leser!

Hab ja seit längerem eigentlich nix mehr über meine Arbeiten gepostet, also hier ein wenig Nachholarbeit:
Letzten Freitag lief im Prinzip gar nix, da die eigentliche Arbeit erst am Nachmittag folgen sollte, ich es aber bis dahin geschafft hatte, mich mit einem vergammelten Thunfischsalat krankenhausreif zu futtern. xPPP
Naja, gestern ging jedenfalls mal die Arbeit weiter und ich durfte helfen, eine Realtime-PCR [RTq-PCR] anzusetzten (im Prinzip eine PCR bei der während den Heiz-Zyklen über Fluoreszenzstoffe gemessen wird).
Außerdem durft ich meine erste eigene PCR starten (da meine allererste nicht ganz so genial gelaufen ist).

Heute war einges zu tun & sehen:
- Ich durfte wieder helfen, eine RTq-PCR vorzubereiten
- Ich durfte meine PCR + Agarosegelelektrophorese starten
Ergbnis der PCR: Niente, nix, null, nada- leider (so gut wie) GAR NIX geklappt :P Naja, shit happens!
- Ich durfte bei der Leucozytenexktraktion & Zucht aus Blut zusehen. Dabei werden im Prinzip die Leucozyten (w. Blutkörperchen) von den Erythrozyten (r. Blutkörperchen) durch einen chemischen Stoff getrennt, der die Erys absinken lässt und einen darüber schwimmenden Leuco-Ring bildet. Der wird dann abgesaugt und in ein Nährmedium bei 37°C gegeben. Jetz schwimmen die da drin und hams kuschlig warm. Die anderen, fertigen (Leuco-)Zellkulturen die wir behandelt haben, hams wohl nicht mehr so kuschlig- die stecken jetz im Eisschrank bei -70°C :O
- Ich durfte beim Vorbereiten einer MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) helfen. Dabei wird durch die Zugabe einer Gensonde eine spezielle Partie der GESUNDEN DNA repliziert und durch Analyse der replizierten Partien kann gesehen werden, ob Mutationen vorliegen.
Die Proben dafür haben wir auf die Gerichtsmedizin gebracht, weil die RTq-PCR Maschine hier kaputt is. :P
Auch die Resultate von gestern konnten wir gleich mit abholen; leider waren (wahrscheinlich durch einen Komma-Fehler) die Werte auf 25.000.000 (Mio.!) statt 25,00. Naja, Panama passiern!

Hier findest du Platz für deine Forschungsdokumentation.

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Dienstag, 13. Juli:
Hab gerade meine erste "PCR" (Polymerase chain reaction) vorbereitet und gestartet. Bei der "PCR" wird DNA durch Zugabe von Chemikalien in mehreren aufeinanderfolgenden Heizzyklen vervielfältigt. Um die DNA zu vervielfältigen braucht es aus chemischer Sicht gesehen vor allem Nukleotide (das Rückgrat der DNA-Helices), eine (hitzebeständige) Polymerase und zwei "Primer" (forward und reverse), die den zu vervielfältigenden Bereich des Gens bestimmen. Hinzu kommen noch Deionat, Puffer, eine DNA-Probe, und ein gewissen Zaubertrank namens "Betain". Danach ab in die PCR damit und da das ganze jetzt so ca. 2 h dauern wird, bin ich jetzt (~ 14:30) heute schon mal entlassen- ein Hoch auf die Technik! :D

Mittwoch 14. Juli:
Heute war ein interessanter Tag mit Einigem zu tun! :D
Losgelegt haben wir mit einer Agarosegelelektrophorese; eine Methode bei der man die zuvor im PCR vervielfältigte DNA unter angelegter Spannung durch ein Agarose-Gel (ähnlich wie eine Gelatine-Platte) hindurchlaufen lässt. Umso größer die DNA-Fragmente sind, desto weniger weit können sie durch das Gel wandern. Man kann die Verteilung der DNA mittels einer DNA- "Leiter" (ein Mix aus DNA- Stücken verschiedener Längen) kontrollieren. Dies geschieht unter Einwirkung von UV-Licht und man sieht dann, ob die Vervielfältigung der DNA bei der PCR hingehauen hat, da unter diesem Licht die gewanderten floureszierenden Stränge leuchten sollten und leuchtende Streifen sichtbar sein sollten.
Zweiter Punkt des Tages war eine Aufreinigung der PCR- Produkte mittels "Exo-SAPit". Dieses Mittel besteht zum einen aus Exonuclease, wodurch die restlichen Primer und einzelnen DNA-Stränge entfernt werden und zum anderen Teil aus "Shrimp Alkaline Phoshatase", wodurch die Dinukleotidphosphate enfernt werde, die zu Beginn für die PCR hinzugefügt werden mussten. Dies ist nötig, um beim später folgenden Sequenzieren (Ermittelung des Basencodes der vervielfältigten DNA-Fragmente) Analyse-Fehler durch Rückstände zu verhindern.
Und last but not least haben wir heute schließlich die Sequenzierung vorbereitet, sodass wir morgen das Gen auf Mutationen überprüfen können.

Donnerstag 15. Juli:
Heute wurde die Sequenzierung abgeschlossen und wir konnten einige Mutationen feststellen. Leider wurden nicht alle Exone vollständig richtig sequenziert, weshalb morgen oder nächsten Montag wahrscheinlich wieder dieselbe Sequenzierung anstehen wird.
Mein größter Teil des Tages bestand darin, DNA-Sequenzen für die Bestellung von sogenannten "Gensonden" für eine MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) herauszusuchen und zu organisieren. Diese Gensonden sind kleine einzelsträngige DNA-Fragmente, die aus 2 Teilen (rechts & links) bestehen und sich an ausgewählte Bereiche des Gens zu einem einzelnen Teil zusammenschließen- wenn alles übereinstimmt (d.h. keine Mutationen vorhanden sind). Anschließend muss man diesen Gensonden-Probenmix wieder in eine PCR-Apparatur geben und kann schlussendlich anhand der vervielfältigten Stücke sehen, wo sich die Probes binden konnten und welche Fragmente demnach in Ordnung sind.
Was mich jedoch wirklich überrascht hat war der Kostenpunkt dieser paar mikroliter Probes - 195€ müssen anscheinend für die paar Probes geblecht werden, die ich jetzt brauche. Ich hoffe wirklich, dass ich die Probes nicht allein aufbrauchen soll; sonst wär das wohl doch ein teurer Spaß für mein 3-Wochen Praktikum.

Langsam fang ich auch an, die Vorteile am Protokoll-Blogging zu entdecken- ich kann mir die zuvor erarbeiteten Sachen nochmal durch den Kopf gehen lassen und dabei alles nochmal viel besser verstehen! :)