Das Medium stellt die Nahrung für die Zellen dar. Da bestimmte Bestandteile des Mediums von den Zellen metabolisiert werden oder bei 37°C im Laufe der Zeit zerfallen, ist es notwendig das Nährmedium zu wechseln.

- Gebläse ca. 15 min vor dem Mediumwechsel einschalten
- Arbeitsfläche säubern
- Medium ins Wasserbad stellen [beim Herausnehmen abtrocknen]
- Handschuhe anziehen & mit Alkohol oder Desinfektionslösung säubern
- Kulturflaschen aus dem Inkubator holen
- Glaspipette in den Schlauch der Vakuumpumpe stecken [ACHTUNG: die Pipette nur am hinteren Ende mit der Hand berühren und mit der Spitze nirgends anstoßen!]
- altes Medium absaugen
- 10-12 ml Nährlösung auf die Kultur pipettieren

Bei schnell wachsenden Zellen soll das Medium ca. alle 3 Tage gewechselt werden [z.B. im Rhythmus: Mo-Mi-Fr-Mo]. Bei langsam oder schlecht wachsenden Zellen wird ein 4 Tages Rhythmus empfohlen [z.B. Mo-Do-Mo]. Weiters kann auch nur die Hälfte des Mediums durch neues ersetzt werden.

Nach dem Wechsel des Mediums empfiehlt sich ein routinemäßiger Überblick über die Vitalität, Morphologie und andere wichtige visuelle Parameter.

- das gesamte Medium [mit den Zellen] wird in ein Plastikröhrchen pipettiert
- wenn sich die Zellen am Boden des Röhrchens abgesetzt haben kann mit der Glaspipette der Großteils des Mediums abgesaugt werden
[- bei Bedarf kann Antibiotikum hinzugegeben werden]
- 10-12 ml Medium ins Röhrchen pipettieren und in die Kulturflasche überführen

Herstellung von Medium:
500 ml DMEM 10% [= Dulbecco's Modified Eagle Medium]
+ 50 ml FCS [= fötales Kälberserum]
+ 50 ml NEA [= Nicht Essentielle Aminosäuren]
+ 5,5 ml Gentamycin [Antibiotikum]

Wenn die Zellen in den Kulturflaschen keinen Platz mehr haben sich auszubreiten [=Konfluenz] sollten sie gesplittet werden:

- Nährlösung absaugen [Zellen kleben am Boden fest & können nicht abgesaugt werden]
- mit 10 ml PBS [=Phosphate Buffered Saline] nachspülen, um das Medium vollständig zu entfernen
- PBS absaugen
- 1 ml Trypsin [oder 2 ml Acutase] hinzugeben & 2 min in den Inkubator stellen [durch das Enzym lösen sich die Zellen vom Boden]
- neue Kulturflaschen [75cm²] vorbereiten und mit Nährmedium befüllen
- wenn sich die Zellen gelöst haben [kann mit dem Mikroskop überprüft werden] Nährlösung hinzugeben und auf die neuen Flaschen aufteilen

- Medium [z.B. aus den 6-Well-Platten mit Glasplättchen] absaugen
- 2 mal mit PBS spülen
- ca. 1-2 ml PFA [=Paraformaldehyd] in jedes Well pipettieren, damit die Zellen fixiert werden [die Zellen werden getötet und erstarren]

20-30 min warten [hängt von der Dicke der Zellschicht ab]

- PFA absaugen
- 2 mal mit PBS spülen
- ca. 1-2 ml Tris Puffer hinzugeben [Well soll bedeckt sein]

ca. 2 min warten

- 1-2 ml 0,3% Triton in jedes Well pipettieren

ca. 15 min warten

- 3 mal 5 min mit PBS waschen
- PBS + BSA [1%=1g auf 100 ml]

60 min warten

- Glasplättchen mit einer Pinzette entnehmen [um weniger Antikörper zu verbrauchen] und in eine feuchte Kammer überführen
-etwas Flüssigkeit auf die Plättchen pipettieren
- Flüssigkeit entfernen und Antikörper auf die Plättchen pipettieren

Verwendete Antikörper: MAP [Hase], GFAP [Huhn], NESTIN [Huhn], NG2 [Hase] in jeweils einer Konzentration von 1:50, 1:100 und 1:500.

- Glasplättchen wieder in die 6-Well-Platten mit 1 ml PBS gleiten lassen
- 3 mal 5 min mit PBS spülen
- Plättchen wieder zurück in die Feuchtkammer legen und je 200 µl Antikörper hinaufpipettieren

auf MAP & NG2: Goat Anti-Rabbit [1:200]
auf GFAP & NESTIN Rabbit Anti-Chicken [1:200]

Nach 2-3 Stunden sollte eine Fluoreszenz beobachtet werden können.

Damit z.B. NT2 Zellen auf den Platten festwachsen, brauchen sie eine Polyornithin/Laminin/Gelatine [P/L/G]Beschichtung.

- in jedes 6-Well 0,5 ml fertig gelöstes Polyornithin pipettieren und 10 min bei 37° C inkubieren [vorher darauf achten, dass die ganze Fläche des Wells mit Flüssigkeit bedeckt ist]

- mit 2 ml PBS pro Well spülen und 10 min inkubieren

1 Stunde trocknen lassen

- 1 µl Laminin / 1ml PBS in jedes Well pipettieren

3 Stunden inkubieren

- Gelatinelösung hinzugeben [bevor man das Medium mit den Zellen auf die beschichteten Platten gibt, muss die Gelatinelösung abgesaugt werden]

Nach dem Überführen setzten sich die Zellen am Boden ab!