Heute war mein letzter Tag im Labor. Ich habe diesen Arbeitstag eigentlich hauptsächlich damit verbracht, schon gelernte Methoden erneut anzuwenden: ich habe also wieder PCRs und eine Gelelektrophorese gemacht und natürlich wieder DNA-Messungen.

Zwei lehrreiche Wochen sind nun zu Ende. Doch man soll ja schließlich aufhören, wenn es am schönsten ist!

Leider sind keine Ecoli-Bakterien in der Petri-Schale gewachsen, was also bedeutet, dass die Ligation nicht geglückt ist, weil einfach zu wenig DNA da war. Daher haben wir gleich einen zweiten Versuch gestartet und eine neue Ligation gemacht. Nach drei Stunden Ligieren habe ich dann einfach die Transformation vorgenommen. Mal sehen, ob dieses Mal Zellen wachsen werden.

Heute standen auch noch ein paar Messungen auf dem Programm. Und zwar habe ich ja gestern Flüssigkulturen von zwei verschiedenen Bakterienkulturen gemacht. Die eine beinhaltet die Plasmide mit den Genen gcvB und GFP und die andere ein Plasmid mit dem GFP-Gen und eines ohne gcvB. Durch die Messung der OD und der Fluoreszenz konnten wir so zeigen, dass gcvB keinen Einfluss auf GFP hat.

Ja ja, der Laboralltag ist manchmal gar nicht so einfach!! Der heutige Tag ist nämlich durch viele Wartezeiten zwischen den verschiedenen Schritten gekennzeichnet! Tatsächlich steht nun die Transformation auf dem Programm: Und zwar führen wir heute das Plasmid, das hoffentlich (!) die gewünschte DNA-Sequenz beinhaltet, in Escherichia Coli Zellen ein, und lassen dann einen Stamm auf einer Petri Schale wachsen. Doch zunächst einmal muss das Plasmid in die Zellen gelangen. Dafür verwenden wir Ecoli Zellen, die bei -80°C gelagert wurden. Diese stellen wir dann auf Eis, damit sie ganz langsam auftauen können. Danach fängt auch schon die Transformation, also die Aufnahme der DNA an. Wir stellen zuerst einmal die verdaute DNA-Sequenz ebenfalls auf Eis, und vermischen sie dann mit den Ecoli-Zellen. Danach verändern wir öfters die Temperatur - zuerst 42°C, dann wieder auf Eis- um die Zellen zu stressen und so die DNA-Aufnahme zu fördern.

Um den Zellen nun die Möglichkeit zu geben, sich von diesem "Stress"^^ zu erholen, muss ihnen nun ein besonders nahrhaftes Medium angeboten werden. Das hier eingesetzte, selbst präparierte SOC-Medium, beinhaltet viel Glukose, was besonders gute Voraussetzungen für die Zellen darstellt. Da die Probe, die nun die Zellen und die DNA beinhaltet, steril bleiben soll, wird das Medium einfach unter einer Flamme dazugemischt, da die Hitze die Bakterien in der Luft einfach abtötet und so verhindert, dass die Probe kontaminiert wird.

Die gleiche Prozedur wird nun noch zweimal wiederholt, um zwei Kontrollproben zu machen, die jeweils Ecoli-Zellen und ein Plasmid (einmal pxG10 und einmal pxG30) beinhalten, aber keine DNA. Alle drei Proben werden dann anschließend auf 37°C gelagert, damit sich die Zellen gut erholen können.

Eine Stunde später habe ich dann die Petrischalen, die ich schon am Vortag mit einer selbst gemischten Gelose eingegossen hatte, aus dem Brutraum 37°C geholt, um nun darin die drei Zellkulturen wachsen zu lassen. Hier habe ich also erneut steril gearbeitet, unter einer Flamme. Die verwendete Gelose beinhaltet neben Agar-agar auch noch das Antibiotikum Chloramphenicol. Es können also nur diejenigen Bakterien darauf wachsen, die das Plasmid mit der Antibiotikumresistenz auch aufgenommen haben. Mal sehen, ob die Kulturen bis morgen auch wirklich gewachsen sind!!

Der zweite Labortag ging gleich einmal mit der "Verdauung" der DNA-Sequenz los. Bei einer Verdauung wird eine gewisse Sequenz mit Hilfe von zwei Restriktionsenzymen an den Enden, den sogenannten Restriktionsschnittstellen, geschnitten. Somit kann diese Sequenz anschließend von einem bestimmten Plasmid aufgenommen werden. Wir haben also die Enzyme NheI und Mph1103I mit einem Puffer, das für eine gute Umgebung sorgt, und der DNA-Sequenz vermischt. Nach dreistündiger Verdauung habe ich noch den selbstgemischten blauen Farbstoff Loading dye hinzugefügt, damit die DNA auf dem Agarose-Gel sichtbar wird. Danach habe ich die verdaute DNA auf das Agarose-Gel geschüttet und die gestrige Messprozedur einfach wiederholt. Dieses Mal war die DNA-Länge um zirka 20 Basenpaare kürzer, da diese ja durch die Enzyme weggeschnitten wurden. Darüber hinaus habe ich die migrierte DNA unter einer UV-Lampe im Gel sehen können, und sie rausgeschnitten. Anschließend gelang es mir, die DNA durch die Zugabe zweier Lösungen und durch zahlreiche Zentrifugierungen von dem Gel-Stück zu befreien. Ich hatte aĺso heute viel zu tun!!

Der nächste Schritt war dann die Ligation, also das Einführen der DNA-Sequenz in das Plasmid pxG-10, das darüber hinaus auch ein Gen, das gegen das Antibiotikum Chloramphenicol resistent macht, besitzt. Dafür haben wir einfach die DNA mit dem Plasmid, einem Puffer und der Ligase vermischt. Ich werde aber leider erst übermorgen erfahren, ob diese Ligation auch wirklich geglückt ist, wenn die Zellen, in die wir morgen das Plasmid einführen, auch wirklich wachsen!!!

Neue Woche, neues Glück. Diesen Montag ging es nun ins Labor, dem Mfpl in der Dr Bohrgasse 9, um unsere Hypothese bezüglich des Gens b3774 als Target von gcvB mit einem Experiment zu überpüfen. Und zwar besteht dieses darin, die vermutete "Target-Sequenz" zu klonieren, sie dann in ein Plasmid unmittelbar vor dem GFP-Gen, das für das Grün floreszierende Protein kodiert, zu positionieren und dieses Plasmid später in eine Escherichia Coli Zelle einzuführen. Das Ziel ist es, zwei verschiedene Escherichia Coli Zellen zu machen: Die eine soll noch dazu ein Plasmid mit dem gcvB-Gen beinhalten, die andere ein Plasmid ohne gcvB-Gen. Durch das Messen der synthetisierten Protein in beiden Fällen könnte nun festgestellt werden, inwiefern eine Interaktion vorliegt.

Doch bevor es soweit ist, mussten wir einmal die gewünschte Sequenz klonieren. Zunächst musste ich dafür also das richtige Pipettieren mit Mikropipetten üben, denn hier muss sehr präzise gearbeitet werden und zwar mit Mengen, die nur einige Mikroliter betragen, was nicht immer ganz einfach ist!!

Danach ging es auch schon mit der PCR (Polymerase Kettenreaktion) los, eine Methode mit der wir die DNA-Sequenz reichlich vervielfältigen konnten. Tatsächlich haben wir dafür unter anderem das ganze Genom von eColi mit sogenannten Primern (kurze DNA-Stücke, die den Anfang und das Ende der zu klonierenden Stelle festlegen) und der DNA-Polymerase, die für die Verlängerung einer Sequenz zuständig ist, vermischt. Durch das häufige Verändern der Temperatur in der PCR-Maschine gelang uns letzten Endes das Klonieren.

Danach musste das PCR-Produkt überprüft werden. Dafür haben wir ein selbstpräpariertes Gel, das hauptsächlich aus Agarose besteht, verwendet, und wir haben einfach geschaut, wie weit die entstandene DNA darauf migriert. Diese Migration gibt uns dann die Länge des DNA-Stücks in Basenpaaren an. Da die zu erwartende Länge ja durchaus bekannt ist, konnten wir die klonierte DNA damit vergleichen. Wir kamen so zu dem Ergebnis, dass die PCR durchaus geglückt war! Zu guter Letzt haben wir noch mit einem bestimmten Gerät, dem Nanodrop, die Menge an DNA gemessen. Und das war's auch schon für heute!