Am Montag stand wieder eine Trafo an, aber mit anderen Mutanten.
Außerdem stand noch unsere erste PCR an. PCR ist die Abkürzung für Polymerase Kettenreaktion. Wir machten sie zuerst praktisch, danach folgte während einer Wartezeit ein theoretischer Überblick über PCR. Bei einer PCR werden bestimmte DNA-Sequenzen mit Primern marktiert und applifiziert (= vermehrt). Dadurch dass die Fragmente dann unterschiedliche Größen haben, lässt sich zB bestimmen ob die Zellen haploid oder diploid sind. Die ganze Prozedur ist aber sehr aufwendig, weshalb ich sie hier nicht vollständig beschreiben werde.

Am Freitag gab es nicht viel zu tun, da an diesem Tag der "Doc-Day" stattfand, bei dem Diplomanten und Dissertanten einmal pro Semester ihre Arbeit mittels Postern und Präsentationen vorstellen. Wir haben uns zwar die Poster angesehen und auch einen Vortrag anghört, doch es war recht kompliziert da alles auf Englisch und sehr speziell ist ;)

Heute widmeten wir uns einer Lipid Extraktion.
Die Hefezellen kamen in ein Bahältnis mit Wasser, Chloroform, Ethanol und kleinen Glaskügelchen. Die Glaskügelchen sollen die Zellwand der Hefe mechanisch aufschließen. Die Mischung von Choloform und Wasser hat den Sinn, dass die Fette sich in Chloroform lösen, die Proteine und Salze aber in Wasser. So sollen die Fette möglichst frei von Salzen und Proteine aufbereitet werden können. Die unerwünschte, sogenannte wässrige Phase kann dann mit einer Vakuumpumpe vorsichtig abgesaugt werden sodass nur noch Lipide und Chloroform, also die organische Phase überbleibt. Der Vorgang ist in der Praxis allerdings recht schwierig weshalb öfters zentrifugiert, mit Chloroform versetzt und abgesaugt wird. Das was an Chloroform enthalten ist wird dann mit Stickstoff verdampft. Es wird deswegen Stickstoff verwendet, da mit Luft die Lipdie oxidieren würden.
Da wir jedoch auf spezielle Lipide aus waren, die Sphingolipide, mussten wir diese noch isolieren. Dafür wandten wir ein Verfahren an, das "Milde Alkaline Hydrolyse" heißt. Dabei werden alle Fettsäuren bis auf die Sphingolipide zerstört indem man die Verbindunge zwischen Glycerol und Fettsäure, wie sie in den anderen vorkommt, zerstört. Bei Sphingolipiden aber verbindet sich die Fettsäure über eine NH-Brücke mit Sphingosin. Am Schluss wird die Reaktion mit EDTA gestoppt. Dann wurden die Lipide wieder extrahiert, nach dem gleichem Muster wie oben beschrieben. Die so verbliebenen LIpide wurden dann in Isopropanol gelöst.

Heute stand unsere erste Trafo (Tranformation der Plasmide in Hefezellen) an. Wieder lief die ganze Arbeit nach einem vorgegebenen Protokoll ab.
Am Anfang haben wir die optische Dichte der Zellen mit einem Photometer ermittelt, um die richtige Menge an Zellen in unseren Proben zu haben. Die daraus errechnete Menge wurde in YPD (flüssiges Nährmedium) gegeben und 4,5 Stunden lang inkubiert.
Dann wurden die Zellen 5 Minuten lang zentrifugiert, der Überstand weggeschüttet, steriles Wasser beigegebn und nochmals zentrifugiert. Damit soll erreicht werden dass nur noch Zellen überbleiben und möglichst wenig YPD. Danach wurde Litiumacetat dazugegeben, was benötigt wird um die Membran der Zellen zu öffnen. Die Zellen mit dem LiAc werden dann in ein steriles Eppi transferiert. Wieder wird zentrifugiert, der Überstand mit einer Pipette entfernt und neues LiAc dazugegeben. Nach einer weiteren Zentrifugation und Entfernen des Überstands werden die Zellen in ein neues Eppi pipettiert und PEG (ein Polymer), wieder LiAc, Träger DNA von Lachs Sperma (Um die Plasmid DNA vor Abbau zu beschützen), natürlich die Plasmide und steriles Wasser dazugegeben. Das ganze wird mithilfe eines Vortex vermischt, was schwierig war, denn durch das PEG wird die Mischung sehr dickflüssig.
Dann beginnt eine lange Wartephase, denn die Mischung wird zuerst bei 30°C und dann bei 42°C inkubiert, jeweils für 30 Minuten.
Sobald die Zeit abgelaufen ist, werden 2 und 20 Mikroliter der Mischung genommen und auf eine vorbereitete Medium Platte plattiert. Dann werden sie bei 30°C für 2 bis 4 Tage inkubiert.
Außerdem durften wir heute zusehen wie unser Betreuer Oskar ein DNA Gel anfertigte. Da der Hauptbestandteil Ethidiumbromid ist, der im Verdacht steht krebserregend zu sein, durften wir nichts anfassen. Das Gel wird mit Agar geliert und ist von der Struktur her wie ein Netz. an einem Ende werden die Proben aufgetragen, dann wird Strom angeschlossen. Die negativ geladenen DNA-Stränge oder Plasmide wandern so zum positiven Pol. Je nach angelegter Spannung lässt man das Gel eine halbe bis eine Stunde "laufen". Danach wird durch das Ethidiumbromid, das sich in der DNA verankert, sichtbar, wo die DNA ist und daraus kann man Schlüsse über die Göße ziehen.
Dazu kam heute auch noch ein wenig Theorie über den Aufbau von Lipiden.

Heute haben wir Plasmide aus E.coli Bakterien isoliert. Die Arbeitsschritte waren ganz genau durch ein Protokoll festgelegt. Zuerst werden dazu die ONC (overnight culture = über Nacht gewachsene Zellen) zentrifugiert, damit sich die meisten Zellen am Boden von kleinen Plastikgefäßen (sogenannten Eppendorf Gefäßen mit 1,5 ml Volumen) ablagern. Danach werden sie mit verschiedensten Lösungen gereinigt und schließlich nochmals zentrifugiert. Nach ein paar weiteren Lösungen, Reinigunsverfahren und Zentrifugieren erhaltet man schlielich die gewünschten Plasmide in nukleasefreien Wasser. Diese werden bei -20°C gelagert. Das Ganze dauert ungefähr eine halbe bis eine dreiviertel Stunde.
Nach der Mittagspasue gab es dann noch einiges an Theorie:Oskar erklärtte uns anschaulich die verschiedenen Fettsäuren und deren Isolation. Wichtig dabei ist herrauszufinden welche Fettsäuren in welchen Konzentrationen vorkommen. Dabei wird ein GC-MS (Gaschromatograph-Massenspektrograph) verwendet. Davor muss man die Fettsäuren aber noch derevatisiert, dh die Hydroxyl-Gruppe (OH) wird durch Zugabe einer Siliziumverbinden abgespalten.
Im GC-MS wird ein Mikroliter der Proben nun aufgesaugt und auf 300°C erhitzt. Die Fettsäuren verdampfen und die Moleküre werden ionisiert (elektrisch geladen). Dann werden sie beschleunigt und ihrer Ladung entsprechend detektiert. Aufgrund ihrer Ladung kann man dann auf die Masse rückschließen. Die Auswerung erfolgt durch einen Computer und die Ergebnisse werden graphisch dargestellt,

Heute habe ich mit großer Aufregung den ersten Tag am Institut für molekulare Biowissenschaften in Graz bestanden ;)
Es begann mit einem Meeting des ganzen Labors und ich und noch ein Praktikant wurden allen vorgestellt. Danach erklärten uns unsere Betreuer Oskar und Florian die Grundlagen ihrer Arbeit und ihrer Abteilung, die sich hauptsächlich mit Lipidstoffwechsel beschäftigt. Geforscht wird mit Hefezellen, und zwar einen Wildtyp (Bäckerhefe) und spezielle Mutanten. Der Vorteil der Hefezelle ist dass sie sehr einfach aufgebaut, wächst schnell und ist leicht zu manipulieren.
Flo betreibt außerdem eine Versuchsreihe in der er Plasmide (ringförmige DNA-Stück) auf E-coli Bakterien extrahiert und in Hefezellen transformiert.
Unsere Hauptbeschäftigung heute bestand aus dem Anrichten von festen Medien (Nährböden) für Hefezellen. Dazu werden Glukose, Ammoniumsulfat und YNB (eine Nährgrundlage speziell für Hefe) vermischt und mit Agar geliert. Weiters kommen noch Vitamine, Spurenelemente und Aminosäuren dazu. All das kommt in Petrischalen und sobald es getrocknet ist kann man Hefekulturen darauf züchten. Neben dem festen Medium gibt es auch Flüssigmedien, die häufiger verwendet werden. Mein letzter Arbeitsschritt war das Übertragen von Hefekolonien von festen in flüssiges Medium, die darin bei 30°C über Nacht wachsen.

Am 11. Juli gehts für mich los: Trotz ein paar kleiner Hindernisse beginnt für mich dann das Praktikum am Institut für Molekulare Biowissenschaften in Graz.

Nach ein paar e-mails hatte ich dann am 24. Juni ein Gespräch mit meine Betreuern Florian Schopf und Oskar Knittelfelder bei dem sie mir erklärten was ich machen werde und mir auch das Labor zeigten.

Ich fand alles sehr interessant und freue mich schon wenn ich am Montag mit dem Praktikum beginnen werde :)