Vorletzter Tag meines Praktikums und ich bin ehrlich: Mein bericht im Internet wird langsam schlampig. Nur kurz, was wir heute gemacht haben, bzw. noch machen werden:

Quik-Change
- Verdau mit ECo 47.3
- DNA-Gele gießen und füllen
- fotografieren

Elektrokompetente Zellen
- Platten für Trafo gießen
- Trafo
- ausplattieren

Kristallisationsplatten herstellen

Herstellung der elektrokompetenten Zellen XL2blue

Expression von pMBP-Co1H-S2

Fortsetzung der QuikChange von pMBP-Cp1H-S3 (Ziel: Entfernen der Mutation, die zu einem frameshift geführt hat)

Vorbereitung zur Isolierung der Plasmid-DNA pET22b mittels Miniprep

Quick Change:
Platten angeschaut: Ergebnis: fast nichts gewachsen

Expression:
LB-Medium mit Ampicillin versetzt (1:1000) und angeimpft (etwas vom Kolben von gestern hineingegeben (1:120))
wachsen lassen bei 37°C und 210 rpm
OD600 Kontrolle: mit UV Licht (Wellenlänge 600nm) schauen wir, wie viel schon gewachsen ist (je mehr gewachsen ist, desto mehr wird absorrbiert)
wenn OD600´ca. 0,8 - 1.0
->Probe G herstellen
->Induktion, also Proteinsynthese starten mittels IPTG
-> jede Stunde Probe nehmen, damit wir es später auf Proteingel auftragen und erfahren, wie viel Protein hergestellt wurde

Heute war mein letzer Montag im Forschungszentrum für Biowissenschaften und Gesundheit. Meine letzte Woche hat begonnen und langsam wird es ernst, was meine Projektarbeit angeht.
Seit heute arbeitet eine zweite Genau-Schülerin mit, Julia. Es ist wie eine Rückschau auf meine ersten Tag im labor, wie schnell man doch ein "alter" Hase wird ;)

Diesen Tag haben wir drei verschieden Versuche gemacht: Wir haben die Vorbereitungen für elekrtokompetente Zellen gestartet, unsere PCR aufgereinigt und eine Expression gestartet.

Elektrokompetente Zellen:
Für elektrokompetente Zellen braucht man sehr viel ddH2O, da man ja große Mengen herstellen will. Gut dass wir zu dritt waren, da ist das Wassertragen aus dem Kanister im oberen Stock sher schnell vergangen. Wir haben also Wash-Buffer, SOB Medium und LB Medium hergestellt und anschließend flüßig autoclaviert.

Quick Change: PCR
Die PCR wurden zuerst aufgereingt. Dabei verwendeten wir verschiedene Buffer, die dann durch den Filter zentrifugiert wurden. Unsere DNA befand sich also im Filter. Zuletzt lösten wir den Filter wieder mit Wasser und unsere DNA konnte weiterverwendet werden. Wir führten nun eine Trafo (kurz für Transformation) durch. Dabei werden elektrokompetente Zellen (XL2Blue) mit einem Stromstoss dazu veranlasst unsere DNA aufzunehmen.

LB-Agar/LB-AMP-Platten:
Wir plattierten unsere PCR Proben aus, mit denen wir vorher eine Trafo gemacht haben. Dazu verwendeten wir LB-AMP-Platten, also Platten, die das Antibiotikum Ampicillin enthalten. Grund für das Ampicillin ist, dass nur diejenigen Nakterien wachsen werden, die unser Plasmid aufgenommen haben.
Außerdem plattierten wir unsere elektrokompetenten Zellen vom Typ XL1Blue aus. Wir wollen nämlich morgen eine Kolonie picken und diese dann vermehren.

Expression:
Bei einer Expression wollen wir unser Protein, also die Collagenase H, herstellen. Dazu haben wir die Vorkultur in einer Konzentration von 1:1000 angeimpft. diese wurde anschließend auf 37°c bei 210 bis 230 RPM (rotation per minute) über Nacht gelagert. Unsere E.Coli sollen nämlich wachsen.

So, jetzt habe ich schon länger meinen Blog nicht mehr erneuert und werde es wohl jetzt nachholen.

Am Freitag letzte Woche habe ich so wie immer meinen Tag um 10:00 begonnen. Ich musste nicht so lange arbeiten, daher war auch nicht großartig Zeit, einen ausführlichen Bericht ins Internet zu stellen.

Mit der PCR, die wir am Vortag gemacht haben, haben wir sofort einen Verdau gemcht. Das heißt, dass wir die DNa, die unser Gen nicht aufgenommen hat mit dem Restriktionsenzym DpN1 zerschnitten haben.

Anschließend haben wir eine pH Fine Screen vorbereitet. Leider hatder pH-Wert nicht ganz gestimmt und wir haben sehr lange für das Einstellen des pH-Wertes gebraucht, dass ich nicht mehr zum Pipettieren gekommen bin.

Wir sind also noch schnell in den 20°c Raum im Keller gegangen und haben uns unsere Kristallisationsplatten angeschaut.

Das wars dann auch schon, ein schönes nachträgliches Wochenende.

Donnerstag, wie schnell die Zeit doch vergeht! Nur noch sechs Tage, dann hört mein Praktikum wieder auf. Ob ich was gelernt habe? Ja! Ob ich es noch mal machen würde? Ja!

Aber genug Allgemeines: Was habe ich heute gemacht, bzw. noch vor?
Die Gele die ich gestern mit Iris befüllt habe, wurden heute ausgewertet und meine Reinigung der Proteine hat funktiniert.

Aber Auswertung ist nicht alles, was zum Laboralltag dazugehört. Da gibt es zum einen das Geleinpacken, das wir gloeich am morgen gemacht haben. Nachdem diese Gele vorgestern von uns gegossen worden sind, mussten sie jetzt fachgerecht (also in Acid-Wasser) behandelt und gelagert (im Kühlschrank) werden.

Danach schauten wir uns die befüllten Gele von gestern an, und auch diesmal waren wir mit dem Ergebnis zufrieden.

Dann begannen wir mit den Vorbereitungen für den Quick Change. Bei einem Quick Change tauscht man mittels PCR ein DNA Stück aus und kann so einen Fehler beheben. Bei unserem Vektor fehlt nämlich ein Adenin, und so kommt es zu einer Verschiebung des Leserasters.

Außerdem befüllten wir drei neue Proteingele.

Wie immer begann mein Tag um 10:00 in der Billrothstraße 11. Man bekommt hier ja so richtig das Laborleben mit, inklusiv Geschirrspüler einräumen und Deckeln abwaschen, und so war es für mich nicht ungewöhnlich der wöchentlichen Lab-Besprechung beizuwohnen.

Danach schauten wir uns sofort unsere Bakterien von gestern an und waren eigentlich zufrieden. Auf der Kontrolle ist nichts gewachsen, das heißt, dass sie von Natur aus kein Resistenzgen in sich haben. Auf den anderen Platten konnten wir am Wachstum erkennen, dass sie die Fremd-DNA aufgenommen haben. Wir mussten also die Kolnien der einzelnen Platten auszählen und aufgrund einiger Rechnungen kamen wir dann auf das Ergebnis, dass 5,5*10^6 Kolonien pro Mikrogramm DNA gewachsen sind. Das Ergebnis ist etwas schlechter, als das letzte mal.

Vor der Mittagspause gossen wi noch schnell die Gele, die wir dann für das Auftrennen der Proteine brauchen werden.

Mahlzeit!