Das war unser letzter Tag ....leider :/

Die Trypanblaufärbung: Es ging darum zu erkennen wieviele Jurkatzellen überlebt haben und wieviele gestorben sind. Die Toten waren blau gefärbt, da die Farbe durch die kaputte Zellwand eindringen konnte.
Der erste Schritt dazu war eine bestimmtes Zählplättchen mit der blauen Zellflüssigkeit vorsichtig zu füllen, danach in das Mikroskop einzulegen und auszurichten. Danach durften wir wirklich jedes einzelne kleine Kästchen auszuzählen...
Für die Augen eine Herausforderung^^..
Damit es nicht allzulang dauert zählten wir nur 3 Kästchen und rechneten es auf die gesamte Anzahl wieder auf.

Anschließend kam die DAPI Färbung dran. Das ist eine Methode um herauszufinden ob ein Mycoplasmenbefall vorliegt. Das Dapi wurde mit dem Methanol gemischt um seine Wirkung zu erhalten. Nachdem das Gemisch auf unsere HEK-Zellen kam und 15min in den Inkubator wanderten, wurden sie wieder mit Methanol gewaschen. Mit 340 nm konnten wir auch die wunderschöne Färbung im Mikroskop sehn.

Dann kam noch der hartnäckige Teil unserer Arbeit. Irgendwie funktionierte da nich alles so wie wir es wünschten..der Ölfilm riss ständig im Mikroskop..
Wir sollten jeweils 3 Bilder von CFP-STIM1 mit 433 nm und für die YFP Orai1 mit 513 nm schießen, mit und ohne Fluoroszenz

Zum Schluss schoben wir auch noch unser Proliferationsessay(850 µl MTS-Reagenz, 42,5 µl PMS-Reagenz. 100 µl davon kamen auf je eines von 5 Wells, die bereits mit 500 µl Zellen-Medium-Gemisch gefüllt waren, anschließend kam das Wellplättchen in den Inkubator) in den Photometer um eine Auswertung zu erhalten.

Den Rest des Zellkultur-Vortrages bekamen wir heute zu hören. Danach gings gleich weiter zum praktischen Teil.


Wir führten eine Transfektion mit unseren vorbereiteten Hek-Zellen durch. Dazu nahmen wir ein neues Eppi und füllten es mit 250 µl Medium ohne Zusätze, 1µl DNA und entweder 3,33 µl Orai1 YFP oder 1,25 µl Stim1 GFP. Nach 20 min "Einwirkzeit" entfernten wir 1 ml Medium unserer Petrischale und fügten stattdessen unser Gemisch Tröpfchenweise hinzu. Über Nacht wurde es wieder inkubiert.

Dann gings weiter zum gefährlichen Teil, der Degranulation. Ich kriegte schon die Panik als Sabine, unsere Betreuerin, sagte, dass wir mit krebserrengendem Zeug hantieren sollten ...
Mit Handschuhen bewaffnet versuchten wir vorsichtig mit den Flüssigkeiten nach einem Pipettierschema umzugehn.
Heißt, zuerst pipettierten wir das Medium weg, dann spülten wir es 2 x mit BSA, dann füllten wie die Wellplättchen mit 100 µM Tapsigargin. Nun zum Pipettierschema. Wie angeschrieben, fügten wir nach 10/15/20/30 min Thapsigargin hinzu, zur Referenz ließen wir eins übrig um den Unterschied zu sehn.
nach einer Stunde im Inkubator stoppten wir die Reaktion mit einer Glycinlösung. Darauffolgend ließen es wir die Flüssigkeiten einzeln durch den Photometer laufen, der die Absorption bei 405 nm bestimmen konnte. Die Ergebnisse konnten wir am PC erkennen.

Schließlich führten wir noch eine Elektroporation durch.
Bei den RBL Zellen funktionierte das Ablösen genau gleich wie bei den HEK Zellen, nur dass die Einwirkzeit des Trypsin EDTAs länger ist. Die Rattenzellen sind hartnäckig^^.
Nach dem Zentrifugieren lösten wir die Zellen wieder mit Medium auf und davon kamen 800 µl in ein Eppi plus 7 µg YFP. Anschließend kam das Zeug in ein extra Gefäß für die Elektroproation. Danach muss es schnell gehn, 30 Sekunden um ihnen zu Hilfe zu kommen darf man brauchen um das Nährmedium hinzuzufügen.
Am nächsten Tag wollten wir beobachten wieviele bei den 350 Volt draufgegangen sind.

Wir starteten durch mit einer Vorlesung von DI Dr Barbara Derler, diejenige, die uns zusehn musste wie wir die Pipetten zerstörten^^'

Sie erzählte uns das ABC von Zellkulturen, von der Geschichte über die Haltung von Zellen, bishin zu Zukunftsvisionen und das Einsetzen von gezüchteten Haut/Herzteilen bei Menschen.

Unsere Vierergruppe begab sich gleich danach zu dem ersten Abteil unserer 'Rundreise'. Die Aufgabe war HEK-Zellen umzusetzen, nach der grandiosen Vorführung von unserer Referentin.
Zuallererst muss man 1,5 ml Medium in einem Zentrifugierröhrchen vorlegen, dazu kommen wir erst am Schluss wieder.
Man nehme eine Kulturflasche mit den Zellen die umgesetzt werden müssen. Man schüttet das alte verbrauchte Medium weg und spült es ein paar Mal mit PBS.

Danach lösen wir die Zellen vom Boden mithilfe des Trypsin EDTA's. Das dauert ein paar Minuten, danach muss man den Vorgang der Enzyme stoppen indem man die Zellen ins Medium gibt.
Es wird 5 min in die Zentrifuge gegeben bei 1000 Umdrehungen.
Bei dieser Wartezeit kann man schon 2 Petrischalen öffnen mit jeweils 2 Glasplättchen und mit 2 ml Medium befüllen, die neue Kulturflasche wird ebenfalls mit 8 ml Medium befüllt. Alles muss genau beschriftet werden. (P= Zahl der Passagierung)
Nach dem Zentrifugieren haben wir ein Zellpallet und die Flüssigkeit die weggeschüttet wird. Dann wird 1,5 neues Medium hinzugegeben und mit einer Pipette gemischt, es wird resuspendiert.
Danach ist die Mischung ideal und es können 100µl in die Kulturflasche gegeben werden und 50µl jeweils in die Petris. Die Zellen können nun in den Schlaf gewiegt werden (=>schwenken) und bei gemütlichen 37°C, ~95% Luftfeuchtigkeit und ~8% Co2 im Inkubator "schlafen" und sich vermehren.

am vierten Tag beschäftigten wir uns mit dem Passagieren bzw mit dem Umsetzen der Zellen.
Zuerst müssen die Kulturflaschen beschriftet werden um Verwechslungen auszuschließen. Zellart, Anzahl der Passage und Datum.
Der Behälter besitzt eine Membran wodurch der CO2 Austausch möglich ist, sonst würden die Zellen sterben.

bei der gr/kl Kulturflsche wird zuerst 25 ml/8ml Medium eingefüllt.
Bei den bereits zentrifugierten Zellen, die am Boden sich sammeln, muss der Überstand weggeschüttet werden. Dann wird resuspendiert oder anders gesagt, gleichmäßig im Medium verteilt.
Mit der Pipette muss es etwas gemischt werden und die Zellsuspension kann in ein neues Medium umgesetzt werden. (280µl Zellsuspension bei gr. Flasche)
Danach wird die Kulturflasche geschwenkt und 4-5 Tage inkubiert.

Generell muss passagiert werden wenn der Zellteppich zu dicht wird.
Dann muss der Überstand weggeschüttet werden (die Flasche muss dabei umgedreht sein!)
mit PBS spülen und zwar auf jener Seite wo sich NICHT die Zellen befinden. Danach wird die Flüssigkeit wieder abpippetiert (die Zellen 'kleben' ja noch am Boden fest)
Dann sollten etwa 8 ml/2,5ml Typsin EDTA hinzugefügt werden damit sich die Zellen lösen. (Die Flüssigkeit wird trüb)

3ml Medium mit Zusätzen wird in ein Zentrifugenröhrchen gegeben, wenn sich die Zellen gelöst haben kann man diese ins Zentrifugenröhrchen hinzufügen.
Ab zum Zentrifugieren! (bei 1000 Umdrehungen pro min)
nach dem Zentrifugieren wird der Überstand wieder weggeschüttet und man gibt das Medium dazu. Mischen und 250 µl davon in 25 ml/1,5 ml Medium geben.

Alle Mengen sind nur ungefähre Angaben, generell sind sie nur wichtig NACH dem Zentrifugieren.

die Transfektion!..es gibt diverse Möglichkeiten fremde Gene in Zellen zu schleusen..
die Calciumphosphat-Copräzipitation, die Elektroporation, mit Liposomen, die Mirkoinjektion, die DEAE-Dextran-Methode oder mit Dendrimeren.
Das wichtigste bei der Bearbeitung von Zellen (bzw überhaupt im Labor) - ALLES muss steril sein! Reinigen kann man die Arbeitsfläche mit 80%igen Alkohol (Ethanol).
Zuallererst braucht man für jede Mischung 2 Eppis, dann kam in jedes Eppi 250 µl Nährmittel, das Transfektionsmittel ohne Zusätze (dieses rosa Gemisch). Anschließend 4µl Transfektionsreagenz in die eine Hälfte und die DNA in die andere Hälfte.
Dann konnte man das Transfektionsgemisch zum DNA-mix hinzugeben, mit der Pipette mischen, zuklappen und Beschriften. eine 20 minütige Wartepause ist angesagt. Anschließend kann man die Flüssigkeit auf die Zellen geben und die müssen dann 4 h lang bei 37GradCelsius inkubiert werden.
Diese Arbeit war somit beendet (obwohl wir nur zugesehn hatten^^)
dann konnten wir uns dem Patch-Clampen zuwenden...
ein Misserfolg folgte dem nächsten...entweder war es unsre Schuld und wir zerbrachen unsre Pipetten..oder die Zellwände waren nicht stabil genug..
Trotz all den Niederlagen haben wir die Messungen ausgewertet ->siehe Bilder.

Nach dem Vormittag durften wir uns mit unsren Unterlagen beschäftigen, eine Seite nach der andren und 1000 neue Begriffe von denen wir nichts verstanden hatten..

Tag 2 begann mit der theoretischen erklärung des Ca^2+ Imaging mithilfe des fluoriszierenden Farbstoff Fura-2

Wir lernten wieder das Set-up kennen. Zuerst machten wir ein BHQ-Gemisch (40ml 0mM Ca^2+ und 12µl BHQ, anschließend gemixt), das eine chemische Blockade bei der ER-Pumpe hervorruft.
Bei unserem eigenen Versuch spülten wir die Glasplatte zuerst mit dem Farbstoff, Fura-2(1ml 0mM Ca^2+ und 2µl Fura) der von den Zellen aufgenommen werden soll um sie sichtbar zu machen. Nach 20 min wurde es wieder gespült, nur diesmal mit der 0 Ca^2+ Lösung (jene ohne Calcium).
Nach 20 min konnten wir beginnen.
Ein Tröpfchen Öl sollte auf die Linse um die Streuung des Lichtes zu verringern. Dann setzten das Glasplättchen in die Vorrichtung und setzten den "Absauger" und die "Zufuhr" für die Flüssigkeiten ein.

3 Versuche hintereinander spielte sich das gleiche ab:
Wir fügten 2 min lang eine 0 Ca^2+ Lösung hinzu um den Calcium gehalt in der Zelle zu verringern. Dann etwa 3 min lang die BHQ-Lösung um eine Blockade zu erstellen. Calcium kann somit nicht mehr in das ER (endoplasmatische Redikulum) gepumpt werden. Nun "hungert" die Zelle so nach Calcium, sodass sich alle STIM der Zellmembran genähert haben und erwarten das Calcium.
Schließlich spritzten wir die 2 Ca^2+ Lösung und konnten anschließend am Computer diese Aufnahme sehen.
während wir die verschiedenen Flüssigkeiten dazugegeben haben fotografierte die eingebaute Kamera alle 15 Sekunden 2 Bilder, eins mit der Wellenlänge 340 nm und ein mit 380 nm.
Die Auswertungen konnten wir mit den Programmen Axon Imaging Workbench, dann mit Matlab und dann mit Origin Professional ansehn.

Hallo erstmal, ich bin die Steffi und hab mich für die Gen-au Summerschool beworben.
Wir begannen den ersten Tag mit einer Lösung, genauer gesagt mit einer 20mM EGTA Inrazellulärlösung (für 100 ml), die aus folgenden Bestandteilen besteht:
3306 mg CsMethansulfonat
64,8 mg NaCl
71 mg MgCl2
238,4 mg HEPES
760,8 mg EGTA

Mit einer Milligramm-Waage konnten wir die kleinen Mengen mischen und auf 100ml auffüllen. Danach wurde alles mit einem Magneten verquirrlt und danach wurde der PH-Wert gemessen, der 7,2 haben sollte.

Nach der Mittagspause bekamen wir eine theoretische Einführung zu der Patch-Clamp-Technik. Dabei geht es um die Strommessung bei den Calciumeinströmungen in die Zelle die durch die Orai, bzw Ionenkanäle, kommen. Die Patch-Clamp-Technik benutzt 2 Elektroden, eine außerhalb der Zelle (in die Ca^2+ Flüssigkeit) und eine innerhalb der Zelle, die man mithilfe einer Pipette an die Zelle heranführt.

Danach setzten wir die Theorie in die Praxis um. Zuerst bastelten wir uns Pipetten aus Glasröhrchen mit einem Durchmesser von 1µm.
Wir bereiteten das Mikroskop vor (Plättchen einlegen usw.), befüllten die Pipette mit der EGTA-Flüssigkeit(die das Calcium in der Zelle bindet), richteten die Pipette aus und versuchten diese in Richtung Mitte zu platzieren. Wir sollten die Nadel immer näher zu einer Zelle führen und nach ein paar "Anfangsschwierigkeiten" (sprich die Nadel is uns zerbrochen oder eben die RBL-Zelle :P) klappte es sehr gut und schafften ein "Cell-Attached" und anschließend mit Unterdruck einen "Whole-Cell". Nebenbei konnten wir am Computer beobachten wie sich die elektrische Spannung auf Null zubewegte.

Schließlich konnten wir ein paar Werte ablesen, wie zB die Größe der Zelle oder die Anzahl der Kanäle.