achja, an diesem wochenende-und zwar von samstag auf sonntag-waren mich drei gaaaanz liebe freunde besuchen:

consti, maurer und krulj-danke dass ihr da wart und mit mir linz ein bisschen unsicher gemacht habt! ch vermisse meine hörnchen!

spiderschwein, spiderschwein, er macht das was ein spiderschwein macht!

bussis an euch alle :-*

achdem meine PCR am donnerstag erfolgreich war - siehe letzter eintrag - durfte ich am freitag endlich die Sequenziermaschine betätigen.
und um ehrlich zu sein, mit der liebäugel ich ja schon seit ich hier bin.
nein moment, eigentlich schon set meinem vorstellungsgespräch, wo ich sie das erste mal gesehen habe. davor kannte ich so etwas ja nur aus diesen fürchterlichen unterrichtsvideos aus biologie und da ich meistens direkt vor demprojektor gesessen bin hab ich die herrliche tonqualität der 60er jahre nicht genießen können weil ich durch das rattern der filmrolle(!) dementsprechend abgelenkt war...

aber das eine video, mit der sequenziermaschine, hat mich halt doch so beeindruckt, dass ich für einen kurzen moment den projektor ignorieren und dem sprecher (der jetzt auch schon weit über 90 sein muss) lauschen konnte.

und am freitag wars dann endlich soweit. und heute gleich nochmal!
es ist alles fürchterlich spannend hier, obwohl ich langsam einen krampf vom vielen pipettieren bekomme-aber spaß macht es trotzdem!
aber man muss sich seeehr gut konzentrieren dabei...

nachdem ich vor kurzem erfolgreich fast eine gesamte palette mit pipetten-spitzen auf dem boden verteilt habe musste ich dann am nähsten tag neue einsortieren. nagut irgendwann wäre das wahrscheinlich ohnehin auf mich zugekommen! mit handschuhen und einer riesenpackung frischer spitzen und vielen leeren schachteln habe ich mich also ans werk gemacht. ziemlich zache arbeit,aber mit guter musik (Deftones-Red Pony) war es eigentlich eh ganz okay. das ganze hatte irgendwie etwas meditatives...
aber jedenfalls werde ich mich bemühen in zukunft nicht mehr so viel umzuwerfen!

soviel mal für heute!
liebe grüße,
eure ungeschickte steffi

here comes the update everybody(?) has been waiting for ;-)

sadly the PCR had to wait until thursday, we spent all of wednesday preparing the samples of DNA gained on monday and tuesday.
we added the following:
*)DNA polymerase (an enzyme)-in our case AQ-polymerase
*)primers, complementary to the DNA regions at the 5' and 3' ends of the DNA region
*)Deoxynucleotide triphosphates, the 4 different bases of the DNA

on thursday however we put the tubes into the cycle sequencer!

POLYMERASE CHAIN REACTION
what is it good for?
it is difficult to retrieve large amounts of DNA. however, it needs more than just a single strand to get some proper results!
the PCR basically copies the DNA and makes thousands of identical copies!

DNA polymerase happens in our body everyday, during mitosis and meiosis.

it works like this:
the PC-in our case a palm top-runs a program:
according to the program, the samples are heated up or cooled down , and the requsted temperature is maintained for a certain time.

why?
the samples are heated up to ca. 97°C: at this temperature, the hydrogen bonds break up leaving us with many single strands of template DNA.

the next step is to cool down to 50-64°C:
this causes the primers to get near the part of DNA they are equivalent to. the polymerase starts building up hydrogen bonds again.

during the next step the temperature goes up again to about 72°C.
now the taq-polmerase causes the free triphosphates-Adenin, Thymin, Guanin and Cytosin-to find their matching place alongside the single strands of DNA.

this procedure was repeated 35 times.
after one reaction theamount of dna was doubled. then doubled again. and again, and again, and again...
with a calculator it isn't to hard to realize how efficient this reaction is!

AGAROSE GEL
to find out wether the PCR has been successful, the reslting samples are put into a special gel called agarose-gel. this contains Ethidium Bromide-caution! i had to wear gloves using this because it may cause cancer!
the samples are put into small slots inside the gel,lying in a buffer solution, which is then put under the influence of a high current (90V).
the DNA strands now start moving. small strands move quicker than long ones.
after some time, the gel can be put under utraviolet light: the Ethidium Bromide makes the DNA glow under UVlight. a picture of this called Electrophorose can be seen in this blog.
the long thing that looks like a ladder is an indicator used to find out how many base pairs each sample contains.

the PCR was successful, for all of the samples obviously had some DNA in them! now, i was finally allowed to prepare the samples for the DNA Sequencig Machine!

tadaaaaaaaa!

hallo!

an meinen ersten beiden arbeitstagen habe ich gleich mal 3 sehr wichtige dinge gelernt:

1) mit diesen pippetten umgehen ist gar nicht so einfach wie es ausschaut!

2) zentrifugieren ist ein wichtiger vorgang um die einzelteile der proben voneinander zu trennen-und spaß macht es erst recht ;-)

und 3) laborarbeit ist nicht immer nur spannend-manchmal muss man auch etwas langweiliges tun, z.B. die Eppis (diese kleinen tuben) beschriften. und wenn man dann dieselbe referenznummer zum siebenten mal wo draufschreibt kann das schon ein bisschen nerven...

aber alles in allem gefällt mir meine laborarbeit sehr gut!
im moment schlummern meine DNA proben die ich gestern und heute extrahiert habe im labortiefkühler bei -20°C und warten auf mich, denn morgen darf ich eine PCR reaktion durchführen, worauf ich mich schon sehr freue...

was genau das ist und wie das funktioniert kommt morgen in die forschungsdokumentation ;-)
diese führe ich übrigens auf englisch damit ich sie am ende meines praktikums nur noch zusammenfassen wennn ich meine praktikumsarbeit zu schreiben. die muss nämlich auf englisch verfasst sein!

heute habe ich aber nicht nur mein labor näher kennengelernt!
mein chef und betreuer, Dr. Martin Pfosser, musste ein paar vakuumgetrocknete proben abholen (mit welchen ich dann geich arbeiten durfte) und während wir darauf gewartet haben dass der druckausgleich zwischen vakuum und außenluft stattfindet konnte ich mir den arbeitsplatz einer tierausstopferin anschauen. trotz des etwas strengen geruchs und den gruseligen glasaugen fand ich das doch sehr interessant-so etwas sieht man ja nicht jeden tag!

mehr von steffis abenteuern im labor gibt es dann morgen wieder :-)

hello everybody!
yesterday (monday) was my first day at work: the DNA-laboratory of the Biologie-Zentrum in Linz.

i have spent today and yesterday trying to extract the DNA out of leaves and other samples collected from various plants from the botanic garden in vienna.

yesterday i only worked on 4 samples, in order to get used to the technique, but today i achieved in extracting the DNA out of 16 samples (10 in the morning, and 6 more after my lunch break ).

so how does it work?

first, the sample is put into a tube along with some glass beads. The glass beads grind the sample to fine dust when put into a certain machine.

then two different lysis solutions are added to the sample. doing this, i learned how to use a professional pipette properly, which proved to be quite a lot harder than it looked!

afterwards the tube is incubated at 65°c for 10 minutes, constantly shaking.

the next step is to add the precipitation solution to the tube, mix it by inversion and then cooling it for 5 minutes.

here is where my favourite part comes in:
the tubes are put into the centrifuge 5 minutes where they rotate at 14.000 rpm.
why?
because this way the cellular debris, proteins and polysaccharides-they are pushed to the bottom of the tube-can be discharged of easily.

now i can pipette the supernatant (the liquid without the pelletted cellular material-we don't want this) and put it into another tube-a tube fitted with a filtration column.

this tube again is centrifuged for one minute.
this way, any cellular debris that was not removed in the centrifuge for the first time gets caught in the filter which is thrown away afterwards, however the lysate in the collection tube is kept!

now the binding solution is added to the lysate-it will make the DA stick to the binding column in another tube (which needs to be prepared in the next step). it is very important to mix the liquid and the binding solution very well by inversion!

now the binding column in its separate tube (that’s still empty) has to be prepared:
500 microlitres of column preparation solution are poured into the tube (this solution maximizes the binding of the DNA and the membrane in the column-that way the results will be better), which is now centrifuged for one minute.
the flow-through liquid is then discharged and the column is ready for the DNA!

now 700 microlitres of the lysate are carefully pipetted into the tube containing the binding column. this tube is centrifuged for one minute again. the flow-through liquid is discharged, but the collection tube is retained- it contains the DNA-and put back into the tube.
now the remaining lysate is added to the tube and the whole procedure is repeated.
by now, we have got rid of almost everything except for the dna which got ‘caught’ in the column.

but how can I get it out?

500 microlitres of washing solution (which contains 95% of ethanole) poured over the column. while the tube is centrifuged for 1 minute the washing solution washes out everything left in the column EXCEPT for the DNA. the liquid is then poured away.
the whole thing is repeated, this time centrifuging the tube for 3 minutes.

now the column – containing only DNA anymore – is transferred to yet another tube.

elusion solution (which needs to be warmed before: up to 65°C) is now applied to the column inside the tube that is centrifuged once again for one minute.
this step is repeated once more in order to retrieve as much DNA as possible!

now the column is thrown away, which leaves us with 1 ml of elution solution containing the DNA.
this tube is stored at -20°C, otherwise the DNA would be destroyed.