Hallo!
Wie versprochen hier nun ein paar Bilder, die während der Durchführung eines Western Blots entstanden sind.

Das erste Foto zeigt das Innere eines 37°-Brutschrankes.



Eine Zentrifuge, ein fixer Bestandteil eines biowissenschaftlichen Labors.



Das Photospektrometer, mit dem man den Bradford Test durchführt. Die Schiebeklappe rechts kann geöffnet werden, darunter werden die Küvetten mit den Proben eingesetzt.



Dies sind unsere Proben, auf Eis gelegt. Sie wurden auf diesselbe Proteinkonzentration gebracht und sind bereit zum Auftragen auf das Gel (Die Färbung kommt vom Loading Puffer).



Ich beim vorsichtigen Ausspritzen der Geltaschen, um eventuell vorhandene Luftblasen zu beseitigen.



Die Box mit beladenem Gel.



Bettina knackt das Gel.



Das "Sandwich" in der Blottingkammer wird mithilfe eines Metallstabes von eventuellen Luftblasen befreit.



Die Blottingkammer in der Box.



Zwei Rollbänke, auf denen die Membranen beim Waschen gedreht werden. Die Membranen befinden sich in Zentrifugenröhrchen. Diese sind mit Alufolie umwickelt, um sie während der Behandlung mit dem Sekundärantikörper vor Licht zu schützen.



Hier seht ihr den Scanner mit eingelegter Membran...



...und hier das Ergebnis des Scanvorgangs.



Die Banden ganz links sind Marker-Banden, bei den roten Banden handelt es sich um Actin, bei den grünen um cPARP, ein Protein, welches eine wichtige Rolle beim Apoptose-Vorgang spielt.

Nun kann man mit der Auswertung beginnen, doch das ist eine andere Geschichte...

lg, Tobias

Beim Western Blot handelt es sich um eine Methode zur Identifikation und relativen Quantifizierung spezifischer Proteine in Proteingemischen.
Die Grundidee dieser Methode besteht darin, Proteine in einem elektrischen Feld ihrer Größe nach aufzutrennen und diese dann auf eine Trägermembran zu übertragen, wo sie dann unter Verwendung von Antikörpern sichtbar gemacht werden können (Immundetektion).

Es folgt nun eine genauere Beschreibung der Durchführung eines solchen Western Blots, wobei diese natürlich auch von den im jeweiligen Labor zur Verfügung stehenden Materialien und Geräten abhängig ist.

Zu Beginn eines Western Blot muss man 2ml Lysispuffer herstellen. Der Lysispuffer dient zum Auflösen der Zellstrukturen, damit dann die Proteine gemessen werden können. Um diesen herzustellen, braucht man:

1940µl EORTC ohne MTG
20µl Natriumfluorid (NaF)
20µl Phosphataseinhibitor
10µl Cocktailinhibitor
20µl PMSF

Dann erntet man die zu untersuchenden Zellen, hier beispielhaft beschrieben anhand von drei Petrischalen. Da wir in unserem Fall sowohl die lebenden als auch die schon abgestorbenen Zellen auswerten wollten, muss man zuerst den Überstand aus den Petrischalen in Zentrifugenröhrchen füllen, dann die noch am Boden haftenden Zellen mit 2ml PBS waschen und das wiederum ins Röhrchen füllen. Dann gibt man 2ml Trypsin (ein Enzym, das auch im menschlichen Dünndarm vorkommt) in die Petrischale, um die noch anhaftenden Zellen vom Boden zu lösen und füllt alles wieder ins Zentrifugenröhrchen. Zum Schluss wird dieses Gemisch aus Zellen, Medium, PBS und Trypsin zentrifugiert. Dann wird der Überstand abgesaugt und die Zellpellets werden in PBS resuspendiert und in Eppendorfgefäße überführt.

Für einen aussagekräftigen Western Blot ist es nötig, alle Proben auf dieselbe Proteinkonzentration bringen. Hierfür gibt es den sog. Bradford-Test, mit dessen Hilfe man die Proteinkonzentration in Flüssigkeiten auf Basis ihrer Extinction feststellen kann. Dazu braucht man Glasküvetten (5 für die Standardreihe, 2 für die Leerwerte und je eines für jede Probe). Mit der Standardreihe kann das Fotometer die Proteinkonzentrationen der Proben messen und die Leerwerte dienen zum kalibrieren des Gerätes. Die Küvetten für die Standardreihe enthalten zusätzlich zu je 2ml „Bradford-Blau“:

Küvette Nr. 1 2 3 4 5
PBS 40µl 30µl 20µl 10µl 0µl
BSA 0µl 10µl 20µl 30µl 40µl

Die zwei Küvetten für den Leerwert enthalten nur jeweils 2ml PBS.

Nach dem man also das Photometer kalibriert hat und die Standardkurve erstellt ist, kann man mit dem messen der Proben beginnen. Dazu überführt man 40µl des Überstandes einer Probe in eine Küvette und gibt 2ml „Bradford-Blau“ dazu. Dann stellt man Probe für Probe in das Photometer und lässt sie messen. Am Ende hat man dann einen kleinen Ausdruck, auf dem steht, wie hoch die Proteinkonzentration in jeder Probe ist.

Nun muss man berechnen, wie viel Lysis- und Loadingpuffer man braucht, um die Proben auf dieselbe Konzentration zu bringen. Dazu gibt es in unserem Labor ein Excel-Sheet, in das man nur noch die gemessene Konzentration und die gewünschte Konzentration (bei uns lag diese bei 5µg/µl) eingeben muss. So erhält man eine Tabelle, aus der man ablesen kann, wie viel man von den Proben mit welcher Menge Lysispuffer und Loadingpuffer mischen muss. Anschließend macht man sich ans Werk und stellt die geforderte Mischung her.

Nun entnimmt man 12µl von jeder Probe und füllt sie in ein neues Eppendorfgefäß. Die alten Eppendorfgefäße werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und dann in einem Tiefkühler aufbewahrt. Die Eppendorfgefäße mit den Proben für den Western Blot werden 10 Minuten lang bei 70°C erhitzt. Währenddessen kann man den Runningpuffer herstellen. Man mischt hierfür 380ml destilliertes Wasser mit 20ml NuPage Running Buffer.

Nun bereitet man alles vor, was man für die Gelelektrophorese benötigt: Eine oder mehrere Gelkammern und die Bestandteile der Plastikbox, in die man die Gelkammern stellt.

Wenn die Proben fertig erhitzt wurden, werden jeweils 10µl der Probe in die Taschen des Gels pipettiert (nachdem man etwaige Luftblasen mit einer Spritze ausgeblasen hat). Zusätzlich wird eine Tasche mit einem Proteinmarker beladen, der immer dieselben Banden liefert und später als eine Art Skala dient. Dann füllt man den Runningpuffer in die Gelkammer und prüft, ob nichts ausläuft. Der Rest Runningpuffer wird dann in den übrigen Teil der Kammer geleert und diese wird mit dem Deckel verschlossen. Nun schaltet man den PowerSupply (ein Gerät, das den Strom für den Gellauf liefert) ein und stellt eine Spannung von 150 Volt und eine Dauer von 1½ Stunden ein. Die in den Proben enthaltenen Proteine werden nun durch den elektrischen Strom, der durch das Gel fließt, ihrer Masse nach aufgetrennt. Je größer die Molekülmasse, desto geringer die Laufgeschwindigkeit.

In der Wartezeit mischt man den Transferpuffer. Dafür braucht man 340ml destilliertes Wasser, 40ml Methanol und 20ml Transferpuffer. Dann legt man 6-7 kleine Schwämme in eine Plastikdose und leert den Großteil des Transferpuffers darüber, so dass die Schwämme sich voll saugen können. Dasselbe macht man mit der Membran, die man zusammen mit den Schwämmen später bei der Übertragung der Proteine vom Gel auf die besagte Membran braucht. Die Dosen mit den Schwämmen und der Membran werden in den Kühlraum gestellt und so gekühlt, bis man zur Übertragung kommt.

Nachdem der Gellauf abgeschlossen ist, holt man die zwei Dosen aus dem Kühlraum und bereitet die Blottingkammer vor. Dazu legt man drei der getränkten Schwämme in die Kammer. Dann leert man den Runningpuffer aus der Gelkammer und füllt kaltes Wasser in die Gelkammer, sodass sich alles ein wenig abkühlt (durch den Strom wird die Kammer erwärmt, im abgekühlten Zustand lässt sich das Gel jedoch um einiges leichter ablösen). Nun entnimmt man die kleine Plastikhülle mit dem Gel und knackt sie vorsichtig auf. Man trennt die zwei Plastikscheiben so, dass das Gel auf einer der beiden kleben bleibt (und zwar so vorsichtig, dass es ganz bleibt!). Jetzt tränkt man ein Filterpapier kurz im Transferpuffer und legt es dann auf das Gel. Mit einer Spachtel, die an der Kante geschärft ist, löst man vorsichtig das Gel vom Plastik und legt es dann auf die vorbereiteten Schwämme. Nun kommen noch die Membran und das zweite Filterpapier drauf. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, rollt man mehrere Male mit einer kleinen Walze über den Stapel. Zum Abschluss kommen noch mehrere Schwämme darauf und die Blottingkammer wird mit dem Deckel verschlossen.
Sie wird in die Box gestellt, welche nun mit dem Transferpuffer aus den Dosen und Wasser aufgefüllt wird. Die Box wird wieder verschlossen und der PowerSupply auf 30 Volt und 1½ Stunden eingeschaltet. Nun fließt der Strom jedoch horizontal durch das „Sandwich“ und befördert die Proteine vom Gel auf die Membran.


Wenn die Proteine fertig auf die Membran übertragen wurden, wird die Gelkammer geöffnet und die Membran vom Gel und dem Filterpapier gelöst. Die fertige Membran kommt nun in ein Zentrifugenröhrchen mit 4ml TBS, das allerdings nur das Austrocknen verhindern soll, bis es kurz darauf durch Blockingpuffer ersetzt wird. Der Blockingpuffer nimmt jeden Platz auf der Membran ein, wo keine Proteine sitzen, was wichtig für die weitere Behandlung ist.
Das Röhrchen wird für eine Stunde auf die Rollbank gelegt. Danach kann man 2ml Blocking Buffer entnehmen und 2µl Tween-20 zufügen. Dann folgt ein wichtiger Schritt: Die Zugabe des primären Antikörpers, der im Idealfall nur an das gesuchte Protein binden soll. Der Antikörper wird je nach Protein, das man nachweisen will, ausgewählt. Unser Interesse galt cPARP, einem Protein, das im Zuge der Apoptose in der Zelle erhöht in aktivierter Form vorhanden ist. Somit war die Menge an aktivem cPARP in unseren Proben direkt proportional zum Anteil apoptotischer Zellen.Die Membran muss nun bei 4°C über Nacht inkubieren, damit der Antikörper binden kann.

Am nächsten Morgen beginnt man mit dem Auftragen des sekundären Antikörpers, der an den primären Antikörper bindet und damit die Proteinbanden unter dem Scanner sichtbar macht, indem er ein optisches Signal abgibt. Dazu muss man die Flüssigkeit mit den primären Antikörpern ausleeren und die Membran mit TBS-T waschen. Anschließend werden 4ml PBS und 1µl sekundärer Antikörper eingefüllt. Man lässt das eine Stunde lichtgeschützt inkubieren und wäscht die Membran anschließend wieder mit TBS-T und TBS.

Nun wird die Membran aus dem Röhrchen genommen und gescannt. Die Auswertung erfolgt am Computer. Zum Aufbewahren der Membran muss man sie mit Stripping Solution 15 min. strippen und anschließend waschen und einfrieren.

Viel Spaß beim "Nachkochen" ;-).