Letzte Woche habe ich bereits bei der cDNA-Synthese zuschauen und helfen dürfen, ebenso wie bei der real time PCR, außerdem haben wir uns die Ergebnisse davon angesehen.
Heute wurde dieser ganze Zyklus vervollständigt, denn für eine cDNA-Synthese braucht man selbstverständlich isolierte RNA, also habe ich heute Sheng Yang (ich hoffe man schreibt es so) dabei geholfen, eine RNA-Isolation durchzuführen. Dieser Vorgang ist wirklich äußerst aufwendig, es hat den ganzen Vormittag gekostet.
Zuerst werden die Zellen in eine Mischung aus 350μl Puffer RA1 und 3,5μl beta-mercatoethanol gegeben.
Danach wird diese Mischung in (nennen wir sie mal) Filtertubes pipettiert und eine Minute zentrifugiert. Danach folgen 350μl Ethanol und wieder wird zentrifugiert.
Man braucht neue Tubes, wo man dann den Filter mit dem liebevoll genannten "Zellgatsch" hineinsteckt und abermals pipettiert, allerdings 350μl MDB.
Dann prepariert man die DNase Mixtur, wo man für jedes Tube 10μl rDNase verwendet und 90μl Reaktionspuffer.
90μl dieser Mixtur werden dann direkt auf die Membran des Filters aufgetragen, dann muss man ausnahmsweise nicht zentrifugieren, sondern das Ganze 15 min. stehen lassen (bei Raumtemperatur).
Wir haben jetzt also diese 15 min. gewartet und nun kommen wir zum Waschvorgang, der aus drei Schritten besteht.
Schritt 1: 200μl Puffer RA2 in die Filtertube und danach 30 sec zentrifugieren.
Schritt 2: 600μl Puffer RA3 in die Filtertube und danach 30 sec zentrifugieren.
Schritt 3: 250μl Puffer RA3 in die Filtertube und danach 60 sec zentrifugieren.
Nun ist auf der Filtermembran nichts mehr übrig außer der RNA, zumindest sollte es so sein. Auf den Filter werden nun 60μl Wasser pipettiert, die dann eine Minute in neuen Tubes zentrifugiert werden. Nun befindet sic die RNA in diesen Tubes und wird tiefgefrohren, bis man sie wieder benötigt.