3. Woche
17:28 / 23.08.2010
Das Ende meines Praktikums hier an der BOKU naht, was bedeutet, dass es langsam an der Zeit wird, einige Schlüsse und Ergebnisse aus den Daten zu ziehen, die ich in den letzten zwei Wochen gesammelt und ausgewertet habe.
Einerseits die Sache mit den PCRs. Die cDNAs, die ich letzte Woche neu synthetisiert habe, sind leider in drei von vier Fällen nicht viel besser geworden als die alten, d. h. die Genexpression ist auch mit der neuen cDNA auf dem Agarosegel kaum bis gar nicht sichtbar. Unsere Vermutung ist, dass schon die RNA, deren Kopie die cDNA ist, nicht mehr ganz in Ordnung, d. h. degradiert, ist, was sich auch in einer sehr geringen Konzentration (messbar mit einem sehr stylischen gerät namens Qubit) geäußert hat.
Auf einigen Gelen hat sie sich dann aber doch zu einem schwachen Erscheinen herabgelassen, perfekt ist es nicht, aber da die Expression der housekeeping Gene mit der des zu bestimmenden sowieso normalisiert wird, genügt es zum Vergleichen.
Sonst stand diese Woche ganz im Zeichen der Pflanzenbeobachtung, ist doch jetzt der Zeitpunkt gekommen, da die Pflanzen alt genug waren, um sich simulierter Juni-Höhensonne aussetzen zu lassen.
Wie schon in meinem vorigen Beitrag erwähnt, wurden an das zu testende Gen zwei verschiedene Konstrukte angehängt, mittels derer ihre Expression gemessen werden kann.
Die erste Art (das hier angehängte Konstrukt nennt sich GUS) bedurfte einiger Vorbereitung, jeweils 20 Blätter einer zu testenden Linie (fünf bei den Kontrollgruppen) wurden abgeschnitten und in eine Färbelösung eingelegt. Über Nacht haben sich die Blätter je nach Stärke der Expression blau verfärbt. Um die Färbung noch deutlicher sichtbar zu machen, wurde mit Ethanol das Chlorophyll aus den Pflanzenblättern gelöst. Danach mussten die Blätter nach Stärke der Blaufärbung sortiert, fotografiert und ausgezählt werden.
Das andere Konstrukt, GFP, fluoresziert bei Expression grün. Um dies zu sehen, verwendet man ein s. g. Confocal Mikroskop, das die Fluoreszenz mittels Laser sichtbar macht. (Erste Hürde dabei ist mal die Angst zu überwinden, dieses ultracoole neumodische Teil auch ja nicht kaputt zu machen....muss ich das berühren um es zu steuern?) Dass ich mit unsrerer Gruppenleiterin ganze viereinhalb Stunden im lichtlosen Keller des Instituts verbracht habe, um mir die Bilder anzuschauen, spricht wohl für sich... (neben den Bildern der Epidermis des Blattes und des Blattstengels gibt es auch eine Aufnahme eines giftgrün leuchtenden Trichoms vor dem roten Hintergrund der Chloroplasten... traumhaft...)
Nun gut, das wars für diese Woche, mal sehen, was die letzte noch bringen wird, großartiger als die letzten drei kann sie kaum werden, nicht zuletzt wegen der unvergleichlichen Betreuung durch meine gesamte Arbeitsgruppe (ja, mir wird grad über die Schulter gespechtelt ;) )
Einerseits die Sache mit den PCRs. Die cDNAs, die ich letzte Woche neu synthetisiert habe, sind leider in drei von vier Fällen nicht viel besser geworden als die alten, d. h. die Genexpression ist auch mit der neuen cDNA auf dem Agarosegel kaum bis gar nicht sichtbar. Unsere Vermutung ist, dass schon die RNA, deren Kopie die cDNA ist, nicht mehr ganz in Ordnung, d. h. degradiert, ist, was sich auch in einer sehr geringen Konzentration (messbar mit einem sehr stylischen gerät namens Qubit) geäußert hat.
Auf einigen Gelen hat sie sich dann aber doch zu einem schwachen Erscheinen herabgelassen, perfekt ist es nicht, aber da die Expression der housekeeping Gene mit der des zu bestimmenden sowieso normalisiert wird, genügt es zum Vergleichen.
Sonst stand diese Woche ganz im Zeichen der Pflanzenbeobachtung, ist doch jetzt der Zeitpunkt gekommen, da die Pflanzen alt genug waren, um sich simulierter Juni-Höhensonne aussetzen zu lassen.
Wie schon in meinem vorigen Beitrag erwähnt, wurden an das zu testende Gen zwei verschiedene Konstrukte angehängt, mittels derer ihre Expression gemessen werden kann.
Die erste Art (das hier angehängte Konstrukt nennt sich GUS) bedurfte einiger Vorbereitung, jeweils 20 Blätter einer zu testenden Linie (fünf bei den Kontrollgruppen) wurden abgeschnitten und in eine Färbelösung eingelegt. Über Nacht haben sich die Blätter je nach Stärke der Expression blau verfärbt. Um die Färbung noch deutlicher sichtbar zu machen, wurde mit Ethanol das Chlorophyll aus den Pflanzenblättern gelöst. Danach mussten die Blätter nach Stärke der Blaufärbung sortiert, fotografiert und ausgezählt werden.
Das andere Konstrukt, GFP, fluoresziert bei Expression grün. Um dies zu sehen, verwendet man ein s. g. Confocal Mikroskop, das die Fluoreszenz mittels Laser sichtbar macht. (Erste Hürde dabei ist mal die Angst zu überwinden, dieses ultracoole neumodische Teil auch ja nicht kaputt zu machen....muss ich das berühren um es zu steuern?) Dass ich mit unsrerer Gruppenleiterin ganze viereinhalb Stunden im lichtlosen Keller des Instituts verbracht habe, um mir die Bilder anzuschauen, spricht wohl für sich... (neben den Bildern der Epidermis des Blattes und des Blattstengels gibt es auch eine Aufnahme eines giftgrün leuchtenden Trichoms vor dem roten Hintergrund der Chloroplasten... traumhaft...)
Nun gut, das wars für diese Woche, mal sehen, was die letzte noch bringen wird, großartiger als die letzten drei kann sie kaum werden, nicht zuletzt wegen der unvergleichlichen Betreuung durch meine gesamte Arbeitsgruppe (ja, mir wird grad über die Schulter gespechtelt ;) )
