Halbzeit-Analyse
11:29 / 18.06.2010
Lieber Leser, liebe Leserin!
Schon zwei Wochen meines Praktikums an der BOKU Wien sind vorübergegangen, und noch kein einziger Eintrag auf dem Summerschool-Blog!
Was einerseits meine Kollegen und Kolleginnen berechtigt, meine mangelnde Präsenz am Spielfeld des Internets zu bekritteln, mich andererseits in die schöne Lage versetzt, zur Halbzeit meine bisherige Arbeit Revue passieren zu lassen und die gefühlten 2395 (vergebenen und verwandelten) PCRs und etlichen beim Samen-Ausplattieren oder Pflänzchen-Vermessen verbrachten Stunden etwas vollständiger und mit besserem Überblick zu betrachten. Nach 45 Minuten weiß man auch immer alles besser als der Schiedsrichter.
Worum geht es bei dem Projekt überhaupt?
Sehr verallgemeinert ausgedrückt (sollte es Dich näher interessieren und wenn Du Dich von 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronsäure und etiolierten Hypocotylen nicht abschrecken lässt, lasse ich Dir gerne mein Programm zukommen) beschäftige ich mich während dieses Monats mit der Expression eines bestimmten Gens einer Pflanze unter bestimmten Bedingungen (in meinem Fall UVB-Stress), die auf verschiedene Arten sichtbar gemacht und quantifiziert werden soll. Inwiefern verändern sich die Chancen, das Elferschießen zu überstehen, wenn die Sonne scheint. Sozusagen.
Einerseits kann man die Menge der mRNA, die zu einem bestimmten Zeitpunkt (gleich nach der UVB-Behandlung, 2, 4, und 6 Stunden danach) vorhanden war, messen, indem man sie (bzw. eine Kopie davon, die cDNA) vervielfältigt (--> Polymerasekettenreaktion = PCR), dann auf ein fluoreszierendes Gel aufträgt und unter UV-Licht sichtbar macht. Man sieht dann entweder gar nichts (verschossen), ein sanftes Grau auf schwarzem Grund (Latte) oder gleißend weiße Rechtecke (TOR!). Um die Expression des Gens vergleichen zu können, wiederholt man dieses Verfahren mit anderen Genen, die immer etwa gleich stark exprimieren sollten und quasi Referenzwerte bieten.
Nachdem die Fragestellung in meinem Fall lautet, ob die Expression mit einem weiteren Gen (hy5 und dem homologen hyh) in Verbindung steht, heißt das praktisch:
PCRs von cDNA von:
3 verschiedenen Mutanten (hy5, hyh und der Doppelmutant hy5xhyh)
mal
3 verschiedenen Gene, deren Expression getestet werden soll
macht nach Adam Riese und Eva Zwerg
9 PCRs. Aussagekräftige. Schöne. In jeder Hinsicht geglückte.
macht weiters
24399 Fehlversuche. Bei denen fehlt, was eigentlich vorhanden sein sollte (Irrelevantes wie Positivkontrollen z. B.) oder vorhanden ist, was fehlen sollte (Unwichtiges wie Negativkontrollen). Oder jene, die zu hell oder zu dunkel sind, um die Expression auch quantifizieren zu können. Oder solche, die man einfach vergisst zu speichern.
Bei mir sind es derzeit ca. 20 PCRs und die Erkenntnis, dass offensichtlich mit einigen cDNAs etwas nicht stimmt, weil dort jegliche Genexpression fehlt, auch bei den Genen, die eigentlich immer exprimieren sollten (und bei 7 PCRs ist das dann wohl doch nicht auf Praktikantenunfähigkeit zurückzuführen...! Pst! Keine Widerrede!) Diese cDNAs habe ich heute quasi nachproduziert. Vertagung aller weiteren Spiele auf morgen, wenn die Auswechselspieler dann angekommen sind um das A-Team abzulösen.
Die zweite und dritte Möglichkeit, die Genexpression zu messen, besteht darin, die Blätter der Pflanzen zu ernten und die Ausprägung des Gens gleich im Gewebe sichtbar zu machen.
Zu diesem Behufe mussten bestimmte Konstrukte an das Gen angehängt werden, die je nachdem entweder anfangen grün zu fluoreszieren, oder sich mit einer Färbelösung blau zu färben, wenn das Gen exprimiert (.....blinkende Köpfe als neue Art des Torjubels, das wär doch mal was!)
Für diese beiden Experimente habe ich in der ersten Woche in erster Linie Vorbereitungen getroffen, d. h. nachdem ich durch eine Segregationsanalyse herausgefunden habe, welche Linien homo- bzw. heterozygot für das Konstrukt sind, (man nehme einen Haufen Nachwuchsrapidler, stelle sie auf...eine harte Probe (Kanamycin, ein Antibiotikum, ist eine gute Möglichkeit). Jene mit Elferpotential (dem gewünschten Konstrukt) trainieren weiter, die anderen werden aus dem Club geschmissen (brutaler: sterben ab)) habe ich die kleinen Pflänzchen auf Erde gesetzt und in die Wachstumskammer gestellt. Morgen sind die Süßen dann bereit für ihr UVB-Treatment (90 Minuten Soli? Passt. Maniküre gefällig?)
Für einige Linien habe ich auch selbst das Ausplattieren (d. h. Samen auf Nährlösung setzen) übernommen, ich weiß ja nicht, was alle haben, also mir macht das Spaß...! (aber NEIN, das ist keine Aufforderung, mir jetzt sämtliche plating-Aufträge zuzuschieben!)
Eine weitere Arbeit der letzten Woche war die Vermessung einiger älterer Pflanzen zu zwei Zeitpunkten (18. und 23. Tag nach der UVB-Behandlung), d. h. dem Durchmesser der Blattrosette an Tag 18 und der Höhe der Stengel und dem Durchmesser der Blattrosette an Tag 23 (Ohrwurm zum Tag: http://www.youtube.com/watch?v=jLG9ERQOdBw ich weiß ja, dass man mit Pflanzen reden sollte, aber seit wann singen die zurück?! (min 2:20)) Zur Dokumentation wurden die Pflanzen auch fotografiert.
Wenig anspruchsvoll aber relativ zeitaufwändig war dann die Übertragung und Auswertung der ganzen Daten am Computer (copy'n'paste lässt grüßen!)
Kleine Bemerkung am Rande: Was das Institut meiner Meinung nach so besonders macht, ist, dass sich neben all den Leuten, die gerade unansprechbar und hochwissenschaftlich mit ihren Pipetten vor ihren Tubes und Reagentien und Gelen und undurchschaubaren Gerätschaften herumhantieren, immer mindestens einer findet, der vor einem Topf mit kleinen Pflänzchen sitzt und mehr oder weniger liebevoll Samen erntet, Blattrosetten misst oder Blüten bestäubt. Man könnte sich verlieben in die Kleinen.
Also.
Pausenstand: 20:12 im Spiel PCR United gegen FC Ausplattieren und 96:4 im Spiel Vermessene Töpfe (Amateure) gegen Iuventus Excel Sheets
Mit dem reumütigen Versprechen, in Zukunft fleißiger beim Bloggen zu sein
verbleibt
Zoe Prohaska-Pariasek
Schon zwei Wochen meines Praktikums an der BOKU Wien sind vorübergegangen, und noch kein einziger Eintrag auf dem Summerschool-Blog!
Was einerseits meine Kollegen und Kolleginnen berechtigt, meine mangelnde Präsenz am Spielfeld des Internets zu bekritteln, mich andererseits in die schöne Lage versetzt, zur Halbzeit meine bisherige Arbeit Revue passieren zu lassen und die gefühlten 2395 (vergebenen und verwandelten) PCRs und etlichen beim Samen-Ausplattieren oder Pflänzchen-Vermessen verbrachten Stunden etwas vollständiger und mit besserem Überblick zu betrachten. Nach 45 Minuten weiß man auch immer alles besser als der Schiedsrichter.
Worum geht es bei dem Projekt überhaupt?
Sehr verallgemeinert ausgedrückt (sollte es Dich näher interessieren und wenn Du Dich von 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronsäure und etiolierten Hypocotylen nicht abschrecken lässt, lasse ich Dir gerne mein Programm zukommen) beschäftige ich mich während dieses Monats mit der Expression eines bestimmten Gens einer Pflanze unter bestimmten Bedingungen (in meinem Fall UVB-Stress), die auf verschiedene Arten sichtbar gemacht und quantifiziert werden soll. Inwiefern verändern sich die Chancen, das Elferschießen zu überstehen, wenn die Sonne scheint. Sozusagen.
Einerseits kann man die Menge der mRNA, die zu einem bestimmten Zeitpunkt (gleich nach der UVB-Behandlung, 2, 4, und 6 Stunden danach) vorhanden war, messen, indem man sie (bzw. eine Kopie davon, die cDNA) vervielfältigt (--> Polymerasekettenreaktion = PCR), dann auf ein fluoreszierendes Gel aufträgt und unter UV-Licht sichtbar macht. Man sieht dann entweder gar nichts (verschossen), ein sanftes Grau auf schwarzem Grund (Latte) oder gleißend weiße Rechtecke (TOR!). Um die Expression des Gens vergleichen zu können, wiederholt man dieses Verfahren mit anderen Genen, die immer etwa gleich stark exprimieren sollten und quasi Referenzwerte bieten.
Nachdem die Fragestellung in meinem Fall lautet, ob die Expression mit einem weiteren Gen (hy5 und dem homologen hyh) in Verbindung steht, heißt das praktisch:
PCRs von cDNA von:
3 verschiedenen Mutanten (hy5, hyh und der Doppelmutant hy5xhyh)
mal
3 verschiedenen Gene, deren Expression getestet werden soll
macht nach Adam Riese und Eva Zwerg
9 PCRs. Aussagekräftige. Schöne. In jeder Hinsicht geglückte.
macht weiters
24399 Fehlversuche. Bei denen fehlt, was eigentlich vorhanden sein sollte (Irrelevantes wie Positivkontrollen z. B.) oder vorhanden ist, was fehlen sollte (Unwichtiges wie Negativkontrollen). Oder jene, die zu hell oder zu dunkel sind, um die Expression auch quantifizieren zu können. Oder solche, die man einfach vergisst zu speichern.
Bei mir sind es derzeit ca. 20 PCRs und die Erkenntnis, dass offensichtlich mit einigen cDNAs etwas nicht stimmt, weil dort jegliche Genexpression fehlt, auch bei den Genen, die eigentlich immer exprimieren sollten (und bei 7 PCRs ist das dann wohl doch nicht auf Praktikantenunfähigkeit zurückzuführen...! Pst! Keine Widerrede!) Diese cDNAs habe ich heute quasi nachproduziert. Vertagung aller weiteren Spiele auf morgen, wenn die Auswechselspieler dann angekommen sind um das A-Team abzulösen.
Die zweite und dritte Möglichkeit, die Genexpression zu messen, besteht darin, die Blätter der Pflanzen zu ernten und die Ausprägung des Gens gleich im Gewebe sichtbar zu machen.
Zu diesem Behufe mussten bestimmte Konstrukte an das Gen angehängt werden, die je nachdem entweder anfangen grün zu fluoreszieren, oder sich mit einer Färbelösung blau zu färben, wenn das Gen exprimiert (.....blinkende Köpfe als neue Art des Torjubels, das wär doch mal was!)
Für diese beiden Experimente habe ich in der ersten Woche in erster Linie Vorbereitungen getroffen, d. h. nachdem ich durch eine Segregationsanalyse herausgefunden habe, welche Linien homo- bzw. heterozygot für das Konstrukt sind, (man nehme einen Haufen Nachwuchsrapidler, stelle sie auf...eine harte Probe (Kanamycin, ein Antibiotikum, ist eine gute Möglichkeit). Jene mit Elferpotential (dem gewünschten Konstrukt) trainieren weiter, die anderen werden aus dem Club geschmissen (brutaler: sterben ab)) habe ich die kleinen Pflänzchen auf Erde gesetzt und in die Wachstumskammer gestellt. Morgen sind die Süßen dann bereit für ihr UVB-Treatment (90 Minuten Soli? Passt. Maniküre gefällig?)
Für einige Linien habe ich auch selbst das Ausplattieren (d. h. Samen auf Nährlösung setzen) übernommen, ich weiß ja nicht, was alle haben, also mir macht das Spaß...! (aber NEIN, das ist keine Aufforderung, mir jetzt sämtliche plating-Aufträge zuzuschieben!)
Eine weitere Arbeit der letzten Woche war die Vermessung einiger älterer Pflanzen zu zwei Zeitpunkten (18. und 23. Tag nach der UVB-Behandlung), d. h. dem Durchmesser der Blattrosette an Tag 18 und der Höhe der Stengel und dem Durchmesser der Blattrosette an Tag 23 (Ohrwurm zum Tag: http://www.youtube.com/watch?v=jLG9ERQOdBw ich weiß ja, dass man mit Pflanzen reden sollte, aber seit wann singen die zurück?! (min 2:20)) Zur Dokumentation wurden die Pflanzen auch fotografiert.
Wenig anspruchsvoll aber relativ zeitaufwändig war dann die Übertragung und Auswertung der ganzen Daten am Computer (copy'n'paste lässt grüßen!)
Kleine Bemerkung am Rande: Was das Institut meiner Meinung nach so besonders macht, ist, dass sich neben all den Leuten, die gerade unansprechbar und hochwissenschaftlich mit ihren Pipetten vor ihren Tubes und Reagentien und Gelen und undurchschaubaren Gerätschaften herumhantieren, immer mindestens einer findet, der vor einem Topf mit kleinen Pflänzchen sitzt und mehr oder weniger liebevoll Samen erntet, Blattrosetten misst oder Blüten bestäubt. Man könnte sich verlieben in die Kleinen.
Also.
Pausenstand: 20:12 im Spiel PCR United gegen FC Ausplattieren und 96:4 im Spiel Vermessene Töpfe (Amateure) gegen Iuventus Excel Sheets
Mit dem reumütigen Versprechen, in Zukunft fleißiger beim Bloggen zu sein
verbleibt
Zoe Prohaska-Pariasek
